text: NTRK融合与甲状腺癌
  NTRK融合与甲状腺癌甲状腺癌是最为常见的一种内分泌恶性肿瘤, 近三十年来,其发病率呈现持续快速上升的态势。神经营养酪氨酸受体激酶（NTRK）融合是包括甲状腺癌在内的多种肿瘤的致癌驱动因素。NTRK融合甲状腺癌具有独特的病理特征。原肌球蛋白受体激酶抑制剂在NTRK融合阳性甲状腺癌患者中显示出良好的疗效。然而，对于甲状腺癌中NTRK融合的诊断和治疗，还没有权威的建议或标准化的程序。本期我们从 Crit Rev Oncol Hematol 上摘译了由Yanhui Ma等教授发表的一篇文章，他们综合论述了NTRK融合在TC中的最新研究进展，并总结讨论该病的临床病理特征，以及可用的诊断方法和靶向治疗。【关键词】NTRK；甲状腺癌；NTRK融合；Trk抑制剂甲状腺癌（TC）按病理结果主要分为分化型甲状腺癌（DTC）、低分化型（PDTC）、未分化癌（ATC）和髓样癌（MTC），其中，DTC主要包括甲状腺乳头状癌（PTC）、甲状腺滤泡状癌（FTC）和嗜酸细胞癌（HCC）。癌症的进展依赖于多种基因突变驱动引起，其发病机制与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K/AKT）信号通路的失调有关。其中，BRAF和RAS基因点突变或RET/PTC和TRK基因融合可激活MAPK通路。同样，RAS、PIK3CA和AKT1的突变以及PTEN的失活可以触发PI3K/AKT的激活。研究表明，神经营养酪氨酸受体激酶（NTRK）融合是TC等实体肿瘤发展过程中的关键因素，尤其原肌球蛋白受体激酶（TRK）抑制剂在NTRK融合阳性肿瘤中显示出强大的应用潜力。但由于NTRK融合在TC中很少见，许多研究都集中在NTRK融合在其他各种肿瘤中的表现，很少有研究描述NTRK融合在TC中的表现。NTRK家族包括NTRK1、NTRK2和NTRK3基因，它们分别编码TrkA、TrkB和TrkC。TrkA参与疼痛和体温调节；TrkB参与运动、记忆、认知、情绪、食欲和体重；TrkC参与本体感觉。Trk蛋白是由胞外配体结合区、跨膜结构域和蛋白激酶结构域组成的跨膜蛋白。这些蛋白通常在人类胚胎发育期间和完全形成的人类神经系统中表达；它们通过PI3K/AKT、RAS/MAPK和PLC-γ信号通路调节细胞功能（图1）。图1 TRK受体信号通路示意图Trk受体被四种神经营养因子激活：神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养因子4和神经营养因子3。在其与配体结合后，TRK受体在激活区发生寡聚和酪氨酸磷酸化，启动下游信号通路，调节细胞的增殖、分化和生存。NTRK融合、突变和剪接变异以及TRK过表达是肿瘤的致癌驱动因素，NTRK融合是最常见的致癌机制。通常，融合基因是由含有激酶结构域的NTRK基因的3‘序列与融合配体基因的5’序列融合而成的。NTRK融合基因通过转录和翻译产生TRK嵌合蛋白（配体无关的TRK），导致TRK激酶结构域（图2）的配体无关的结构性激活，促进多个下游信号通路的持续激活，从而刺激肿瘤的发生和发展。图2 NTRK融合机制二、甲状腺癌中NTRK的融合在中融合阳性的临床和病理特征与其他肿瘤中的高发现率相比，NTRK融合在TC中的发现率显著较低。研究表明，ETV6-NTRK3是TC中最常见的NTRK融合类型，值得注意的是，NTRK融合在放射性碘难治性DTC、转移性TC或晚期TC患者中更为常见。表1 甲状腺癌中的NTRK融合有学者研究发现，男性和女性的比例显示出类似的动态变化，总体比例约为1：3，但在肿瘤大小方面，并没有表现出较强的关联性，这表明肿瘤大小不是NTRK融合状态的可靠指标。在TC中NTRK融合阳性独特的临床病理特征有助于诊断和预后评估（表2）。研究表明，NTRK融合的肿瘤的病理特征包括混合结构模式、多结节生长、广泛的淋巴血管浸润和慢性淋巴细胞性甲状腺炎，这对临床诊断具有潜在的价值。表2 NTRK融合甲状腺癌的临床病理特征Pekova等报道，与NTRK3融合阳性TC相比，NTRK1融合阳性TC更常表现出多态性、远处转移和侵袭性，而Viswanathan等在一项研究中发现，14个样本中43%存在嗜酸细胞质，36%存在细胞质空泡，包括两例罕见的核内假包涵体。2021年，Kerr等发现了类似的特征，表明这些特征具有诊断潜力。他们还发现，EML4-NTRK3融合的肿瘤中具有一种独特的玫瑰花样微管结构，而这一特征从未被其他学者报道过。NTRK融合阳性的TC也表现出中间核特征（如核沟、延长和假包涵体）。最后，NTRK融合可能不会与其他突变同时发生。因此，有学者在BRAF野生型肿瘤中发现NTRK融合较为丰富。由于样本大小的限制或NTRK融合蛋白的多样性，很难确定NTRK融合蛋白在TC中的细胞和组织特异性表达模式。然而，当患者表现为TC表现为多结节状生长、混合结构模式、广泛的淋巴转移和某些罕见的表现（如中间核和核内假包涵体）时，应评估NTRK融合状态。融合在儿童中的应用到目前为止，大多数NTRK融合阳性TC的研究都集中在成人，很少有研究探讨其在儿童中的特点。目前对TC年龄组界限的分歧导致不同研究中儿科患者（18-22岁）的年龄上限存在显著差异。NTRK融合阳性TC在儿童中的患病率>20%，是成年人的8倍。而BRAF/RAS突变在成人TC中最常见，RET/NTRK融合在儿童TC中最常见。一项在美国匹兹堡的回顾性研究表明，在13%（10/76）的PTC病例中发现了NTRK融合。这些肿瘤的主要特征是甲状腺淋巴管通透性、甲状腺外转移、（8/10）颈外淋巴结转移、（5/10）结外转移和（5/10）肺转移。此外，研究发现，PTC中高度富含NTRK1。由于儿童TC经常出现转移，大多数患者接受手术和放射性碘治疗，然后接受终身甲状腺激素替代治疗。三、NTRK融合的检测目前,检测NTRK融合的方法包括免疫组织化学（IHC）、荧光原位杂交（FISH）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和基于DNA/RNA的下一代测序（NGS），但每种检测方法都存在其优点和不足（表3）。表3：NTRK基因融合鉴定方法的优势与局限性有许多抗体可用于检测NTRK，包括针对共同C-末端序列的PAN-TRK抗体（在TrkA、B和C蛋白中共享）以及针对其他类型的TRK蛋白的抗体。EPR17341系列针对上述共同的C末端序列，是使用最广泛的克隆抗体。PAN-TRK IHC检测不仅针对融合蛋白，而且可能在生理性表达TRK蛋白的正常组织（例如，平滑肌、睾丸组织和神经组件）以及具有神经或平滑肌分化的肿瘤中产生假阳性结果。所以，PAN-TRK-IHC检测NTRK融合阳性肿瘤的敏感性和特异性在不同研究中存在差异。PAN-TRK IHC检测偶尔在NTRK3融合蛋白患者中产生假阴性结果，其潜在因素尚不清楚。总体而言，PAN-TRK IHC被认为是NTRK融合阳性肿瘤的可靠检测方法。FISH因其成本低、周转快、灵敏度高、特异度高等优点而得到广泛应用。这种分析方法可以使用融合特异的探针或分离的探针来识别结构DNA变体。与PAN-TRK IHC相比，FISH在胶质母细胞瘤和胃肠道间充质瘤中显示出更高的检测能力。FISH的缺点包括要求对NTRK基因进行≥3独立检测，以及无法识别配对基因。RT-PCR具有技术成熟、周转快、定量检测、成本普遍较低等特点。然而，它的缺点包括需要患者特定的检测特异性引物，无法检测未知的融合基因，以及可能存在与样本量相关的偏差。NGS被认为是检测NTRK融合基因最有效的方法。它具有高灵敏度、高特异度、可检测未知融合、可同时检测多基因等优点。它的缺点是周转速度慢、工艺复杂、成本高。研究表明，由于NTRK2和NTRK3中含有丰富的内含子，基于DNA的NGS对NTRK3融合基因的检测灵敏度有限。基于RNA的NGS目前被认为是检测NTRK融合的金标准，因为它避免了内含子的参与，并且可以识别融合伙伴、外显子和基因断裂点。但提取的RNA的质量会影响实验结果。潜在的技术液体活检液体活检是一种检测和分析循环肿瘤细胞（CTCs）、循环肿瘤DNA（CtDNA）、循环游离核酸（cf-DNA、cf-RNA和mi-RNA）以及从患者血液和其他体液中释放的细胞外肿瘤小泡（EV）的新技术。ctDNA对伴有BRAF、KRAS、NRAS和TERT启动子突变的早期TC的诊断价值可能有限。但因其非侵入性和检测癌症特异性生物标记物的潜力，近年来得到了极大的关注。在最近的一项研究显示，所有15名PTC患者中携带BRAF V600E突变的ctDNA检测均为阳性，这突显了液体活检在PTC诊断中的潜在实用价值液体活检现已被证明对多种癌症有很强的临床疗效，包括乳腺癌、结直肠癌和肺癌。人工智能随着人类技术的不断发展，人工智能（AI）已成为识别包括TC在内的各种癌症的融合基因、生物标记物和基因签名的强大工具。利用FusionAI系统根据DNA序列预测基因融合断点，可以为疾病发病机制提供线索。可以基于人工智能技术将具有乳头状核特征的非侵袭性滤泡性甲状腺肿瘤与经典的乳头状甲状腺癌区分开来。同样可以基于深度学习的预测前列腺癌ERG基因融合的模型和使用深度学习卷积神经网络预测TC患者的BRAFV600E突变。未来，这一领域的进一步研究可能会导致开发更复杂的基于人工智能的算法和工具，用于识别和验证TC的新诊断和治疗靶点。四、TRK抑制剂的研究现状目前，用于治疗转移性NTRK融合阳性实体瘤患者的药物主要为拉罗替尼和恩曲替尼，两种药物在治疗NTRK融合阳性TC上均表现出不错的疗效。多项研究表明，拉罗替尼增强或恢复了TC的放射性碘摄取。但其仍具有一些副作用，大多数接受TRK抑制剂治疗的患者都经历了1-2级的不良反应，如肌痛、疲劳、头晕和肝转氨酶升高。在NTRK融合阳性肿瘤中，获得性耐药涉及靶内或靶外机制。在NTRK结构域中发现的靶上突变包括溶剂前位替换（TRKAG595R和TRKCG623R），xDFG位置替换（TrkA G667C和TRKCG696A），以及门卫残基位置替换（TRKAF589L）。非靶标耐药性也可能与获得性BRAFV600E突变、MET扩增和KRAS突变有关。但不幸的是，没有靶向药物可用于管理靶外耐药性，未来对TRK抑制剂的研究仍有待发展进步。五、结论NTRK融合是许多实体肿瘤中广泛存在的致癌因素，是重要的临床生物标志物。NTRK融合阳性TC表现出独特的临床病理特征，有助于识别潜在患者。然而，已报道的NTRK融合阳性TC的病理特征需要在大规模临床试验中进一步验证。目前的文献表明，晚期、转移性和/或碘难治性TC患者应该接受NTRK融合状态的评估，因为接受治疗的好处远远超过识别NTRK融合基因所涉及的困难。NTRK融合在儿科TC中更为普遍，且与较差的预后相关。主要的挑战在于筛查NTRK融合阳性实体肿瘤的患者群体。基于RNA的NGS仍然是鉴定NTRK融合的首选方法。然而，目前还没有经济有效的方法可用于全人群筛查潜在的NTRK融合。液体活组织检查和人工智能识别融合基因、生物标记物和遗传特征的潜力也正在显现。然而，必须解决诸如提高准确性和降低成本等挑战，以使这些方法更有效。在这些领域的研究将有助于开发更准确和个性化的方法来诊断和管理TC。Trk抑制剂在治疗NTRK融合阳性TC方面显示出良好的疗效。但是，目前还不清楚TRK抑制剂是否对儿童和青少年有长期影响。仍有必要调查TRK抑制剂在青春期前患者中的安全性。最重要的是，迫切需要为NTRK融合阳性TC建立标准化的诊断和治疗程序。【点评】随着科学技术水平的发展，NTRK融合越来越频繁地出现在多种肿瘤的基因检测中。但NTRK融合在肿瘤中，尤其是甲状腺癌较为罕见，因此常常被忽略。由于NTRK基因存在变异性和低检出性，NTRK的检测仍然存在困难，目前临床上对于此的检测主要有IHC、FISH、RT-PCR以及NGS等。IHC检测具有在操作、经济方面的优势，但其抗体种类繁多，所以目前尚无统一的指南标准。PAN-TRK IHC检测敏感度高、特异性低，其原因在细胞染色和融合伴侣基因，如ETV6-NTRK3融合既可以在细胞质染色，又可以在细胞核染色，尽管ETV6基因编码细胞核转录因子，但是ETV6基因中SAM靶点的亚细胞定位于细胞质。这些特定的融合伴侣会影响PAN-TRK IHC检测。在临床上FISH和RT-PCR是最为广泛使用的检测方法，其中，FISH因其具有较高的敏感性和特异性成为鉴定其他基因重排的金标准，RT-PCR是一种高特异性、快速和经济的检测方法们可以识别典型性和非典型性融合，但目前只能作用于已知的基因伴侣。甲状腺结节诊断中NTRK融合阳性，甲状腺结节恶性风险高吗？在捷克的一项队列研究中，在纳入的989个甲状腺组织中，851个PTC，19个FTC，13个ATC，10个PDTC，10个HCCs，30个边界性甲状腺肿瘤组织，194个良性组织，研究者对对259例患者进行了NTRK融合基因检测，其中126例使用下一代测序。结果发现，在846例甲状腺乳头状癌中的57例（6.7%）和10例低分化甲状腺癌中的2例（20.0%）中检测到NTRK融合基因。因此，术前评估时NTRK融合阳性提示结节恶性风险较高。同时，NTRK融合阳性癌与滤泡生长模式、慢性淋巴细胞性甲状腺炎和淋巴结转移有关。与NTRK3融合的甲状腺癌相比，NTRK1融合甲状腺癌显示出更高频率的多灶性和侵袭性。以拉罗替尼和恩曲替尼为代表的TRK抑制剂在恶性肿瘤的治疗中表现出不错的功效，在NTRK阳性患者的潜在获益巨大。最新研究中，提出这两种药物在部分人群中存在的耐药性，因此，仍需进一步开展相关研究，加快规范化NTRK在TC中的诊治。参考文献：[1]  Ma Y, Zhang Q, Zhang K, et al. 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