text: 基因工程简介
  基因组工程不仅使解析复杂的基因相互作用成为可能，而且使通过合成生物学建立新的方法成为可能。在过去的几十年中，基因组工程技术在数量和可行性方面都取得了巨大的进步。基因组工程诞生于20世纪70年代末，当时多个研究小组发现外源DNA可以被酵母或细菌摄取并随机整合到基因组中。随后的工作表明，这一过程也可以有针对性地发生。Mario Capecchi发现将DNA显微注射到细胞核中会刺激细胞发生同源重组，从而实现基因组的靶向修饰。1989年，他与Martin Evans和Oliver Smithies一起创建了第一个敲除小鼠，这是基因组工程的一个分水岭。 20世纪80年代末也标志着Cre - lox重组系统的引入，该系统由P1噬菌体衍生而来，目前被广泛用于控制基因表达。如今，Cre重组酶在各种启动子的控制下，或以其可诱导的形式，为基因表达提供了复杂的时空控制，特别是在转基因小鼠中。同源重组是基因组工程的基石，但其发生频率较低，限制了编辑效率。为了提高编辑速率，研究人员利用了核酸内切酶的功能，从而产生难以修复的DNA双链断裂。将这些核酸内切酶靶向到特定的位点导致DNA断裂，并迫使细胞进行非同源末端连接( NHEJ )或同源重组修复( HDR )。NHEJ发生在不提供DNA修复模板的情况下，其易错性往往导致突变失活。在HDR的情况下，修复模板指定所需的基因组修改，从而实现精确编辑。除了引入点突变或重组位点外，还可以利用修复模板将目的基因导入到指定的位点。锌指核酸酶( ZFNs )是实现高效靶向核酸酶的第一步。为了构建ZFNs，设计了一系列与特定的基因组位点结合的锌指，随后与Fok I核酸酶融合。识别两个相邻位点的成对ZFNs切割DNA，启动HDR。ZFNs的实用性受限于其较长的合成时间和非模块化的组装过程。尽管计算工具有助于提高靶向性，但不可能为每个基因组位点设计合适的ZFN对。2011年，TALENs被首次报道，标志着基因组工程向前迈进了一大步。该模块化系统基于从黄单胞菌中分离的TAL效应物DNA结合蛋白，与FokⅠ内切酶相融合。一个有经验的科学家可能需要六周的时间才能制作一个ZFN，而一个新手可以在几天内制作一个TALEN ! TALEN技术迅速被研究界采用，Golden Gate TALEN试剂盒成为最受欢迎的试剂盒。TALENs可定制的DNA结合特性也使得设计定制的转录因子来调节基因表达成为可能。正当我们认为基因组工程再好不过的时候，CRISPR (成簇的规律间隔的短回文重复序列) / Cas9系统也随之而来。CRISPR是细菌免疫系统的重要组成部分，它允许细菌记忆和破坏噬菌体。在基因组工程应用中，Cas9核酸内切酶靶向与给定位点同源的向导RNA ( guide RNA，gRNA )，诱导双链断裂。与ZFNs和TALENs一样，CRISPR / Cas9也采用了HDR，但使用RNA来指定编辑，使系统的成本和耗时更少，而且更加精确和可扩展。正因如此，CRISPR / Cas9被证明在高通量基因组工程中具有巨大的价值。CRISPR / Cas9也可以靶向一个生物体内的多个位点，与TALENs一样，该系统也被改编用于其他功能。CRISPRs比TALENs更受研究界的青睐，每周都有使用该技术的新论文发表。随着CRISPR的成功，很容易忘记其他的基因组工程方法.. ..但是这是不对的!另一种基于HDR的方法，即重组工程，普遍应用于在大肠杆菌，用来对基因组或细菌人工染色体( BAC )进行编辑，修复模板两侧50 bp的同源臂在噬菌体重组酶的催化下特异性结合到重组位点。由于修复模板可以通过PCR快速生成，该重组技术与CRISPR一样易于扩展。除了在细菌基因组工程中的应用外，该重组技术也可用于为其他HDR基因组工程方法创建基于BAC的修复模板。在HDR之外，一个令人兴奋的新的基因转移方法是睡美人转座子，它是从古代鱼类的化石中进行重建的。转座子是可移动的DNA元件，因此是基因转移的理想载体。该系统分为两个质粒，一个是含有反向重复序列的目的基因( GOI )，另一个是携带转座酶的质粒。共转染后，转座酶从质粒上切割GOI并促进双链断裂，使GOI整合到基因组中。睡美人转座子被评为2009年&#34;年度分子&#34;，是病毒载体介导的基因转移的有力替代物。随着多种稳健高效的基因组工程方法的问世，我们进入了基因组工程的黄金时代。目前的工作集中在改进这些技术，以确保高特异性和活性，不管所需的靶点(或位点)是什么，希望这些方法在临床上有用。欢迎交流与指正~~~免责声明：推文基于已公开的资料信息撰写，用于传递最新热点资讯，在任何情况下，本文中的信息或所表述的意见均不构成对任何人的建议。如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系本号删除。更多精彩内容欢迎关注和分享公众号