text: Mol. Cell | 亨廷顿蛋白毒性低聚物的形成
  毒性蛋白质的聚集是阿兹海默症、帕金森症、亨廷顿舞蹈综合症等一系列伴随着年龄增长而产生的神经退行性疾病的标志。其中，亨廷顿舞蹈综合症是一种常见的染色体显性遗传的神经退行性疾病，常常伴随着动作不协调，认知退化等明确的表型。这种疾病是由蛋白质聚集造成的，如显性遗传的多聚谷氨酰胺（polyQ）重复扩增。因此，若能从基本细胞病理学方面对亨廷顿舞蹈综合症进行深入研究，特别是关于其蛋白质聚集的生化原理，则有望为研发治疗的药物提供一定的帮助。为了理解亨廷顿舞蹈症蛋白质病理性聚集的具体机制，2022年10月21日，德国马普生物化学研究所F. Ulrich Hartl研究组与Courtney L. Klaips研究组合作在《Molecular Cell》上发表了题为《Formation of toxic oligomers of polyQ-expanded huntingtin by prion-mediated cross-seeding》的文章。研究人员。作者采用的模型生物是酿酒酵母。据报道，这种模型生物曾被用来探索神经退行性疾病聚集的基本原理以及细胞对聚集过程的反应，其细胞环境可以调节疾病相关蛋白的聚集行为。作者发现，当亨廷顿舞蹈综合症蛋白中的polyQ扩增时，其会形成毒性的聚集体；只有当与朊病毒形成的蛋白Rnq1出现时，SDS-resistance（去垢剂抵抗）的Inclusions（内含体）才会形成。Rnq1是一种大小为43 kDa，功能未知的蛋白质，其中包含了谷氨酰胺-天冬酰胺富集的低复杂性区域（Low complexity regions，LCRs），参与了聚集体的形成，称此为，反之则为（图1）。图1. Htt蛋白中polyQ扩增形成聚集内含体为了解特定的细胞环境如何促进相关蛋白的聚集以及朊病毒与polyQ聚集体二者之间的关系，作者表达了一种亨廷顿舞蹈综合症蛋白Htt（Huntingtin）外显子1的polyQ扩展形式——97Q-mCherry（97Q），同时以20Q-mCherry（20Q）作为对照组，其polyQ长度远小于达到聚集水平的polyQ长度。结果显示，含有的细胞中，97Q形成了聚集体（inclusions），而对照组的20Q仍然是弥散分布的信号，并未形成聚集体（图2）。图2.  vs  光诱导对比模型为了检测朊病毒是否会损害蛋白质稳态，作者分别对以及酵母细胞中的3500种总蛋白质组进行对比分析，发现其中只有一小部分蛋白存在不同。同时，作者对细胞内HSP（热休克）蛋白家族的稳定性进行分析后还发现，朊病毒Rnq1虽然与多种蛋白存在相互作用，但不会引起HSP蛋白家族反应，说明其状态与广泛的蛋白质稳态缺陷并没有直接的关系（图3）。图3. 和蛋白质相互作用分析。[b图. 和细胞进行的（label-free）全蛋白质组分析结果；c/d图. Rnq1-GFP在和细胞中经过抗GFP免疫共沉淀（IP）后的（label-free）相互作用组分分析结果；e图.和酵母中CG（融合GFP的细胞质羧肽酶）的变化；f图. 细胞质热应激响应的诱导性]据报道，polyQ聚集体成核作用（Nucleation）与polyQ蛋白质扩展引发的相分离相关。因此，作者推断朊病毒在聚集体形成中可能起着催化的功能。为了验证这一可能性，作者将97Q、20Q与CRY2 PHR融合形成光诱导的模型（图4）后发现，在光诱导的情况下，及均能形成聚集体；在加入97Q后，无论是在光诱导条件还是在黑暗的环境下均可形成凝聚体；在中加入97Q后，需进行光诱导才会形成凝聚体，黑暗环境下无法形成凝聚体；对照组20Q在光诱导条件下，在及细胞中都能形成聚集体，在黑暗环境下则无法形成；照射5分钟并没有导致稳定的聚集核心形成，与mCherry-Opto相比，光诱导聚集体具有较慢的动力学解离速度（约110分钟），这表明polyQ序列之间存在短暂的相互作用。图4. 光诱导形成聚集体模型。[a图. 不同包含mCherry-CRY2（PHR）表达载体示意图；b图. mCherry-Opto在和酵母中的光诱导聚集；c图. 短暂的光诱导后生成聚集体，后在黑暗环境中聚集体的变化；d图. 20Q-Opto和97Q-Opto在和酵母中的光诱导聚集]在细胞实验的基础上，研究人员推断，若要在细胞中形成稳定的polyQ-Opto聚集，可能需要通过细胞生长期间连续照射的光依赖聚集方式来进行催化。作者发现在细胞中，97Q-Opto形成了无需光激活抗SDS聚集物，并且连续照射显著增强了抗SDS的效果（图5）。值得注意的是，长时间照射细胞也会诱导97Q-Opto的抗SDS聚集物形成，但不包括20Q-Opto。为了比较在细胞中通过光诱导聚集形成的抗SDS聚集物与在细胞中形成的聚集物的物理化学特性，研究人员分析了使用去垢剂以及甲酸处理的聚集体稳定性。结果显示以及细胞中的聚集物在稳定性上表现出类似的敏感性，在增加SDS浓度后，这些聚集体逐渐溶解，且这些聚集体容易溶解于甲酸中，这表明它们具有相似的结构特性。据报道，在酵母中，polyQ扩展蛋白的聚集体具有吸附短polyQ序列蛋白的能力，这是影响其产生自行聚集的关键因素之一。因此，研究人员针对细胞中共表达20Q-GFP、97Q-GFP及二者相互之间的polyQ-Opto蛋白的吸附能力进行测试。结果显示，mCherry-Opto的光诱导凝聚体未能吸附20Q-GFP或97Q-GFP。然而，20Q-GFP、97Q-GFP均与20Q-Opto、97Q-Opto的光诱导聚集体发生共定位。由此可以推断出以下三个结论：1、polyQ蛋白质的共聚集主要取决于局部的高polyQ浓度，且是通过光诱导聚集体来实现的，不需要病理性的polyQ长度；2、polyQ蛋白质的共聚集不依赖于SDS-resistance，因为光诱导的20Q-Opto聚集体仍然可以被SDS溶解；3、只有当共表达polyQ扩展形式97Q-Opto和97Q-GFP时，抗SDS共聚集物才能形成。上述结果说明，细胞中光诱导的polyQ聚集体与酵母中的polyQ内含体（inclusion）具有共同的关键特性：它们部分耐SDS溶解，会固定其他可溶性的polyQ蛋白，并且所形成的聚集体与polyQ的长度及浓度依赖的程度相似。图5. 在细胞中形成光诱导聚集体。（a图. 在黑暗或蓝光照射下，表达了相应的Opto蛋白在或细胞中经裂解过滤试验分析的总蛋白量；b图. 在诱导培养基中，97Q-Opto表达在或细胞中，其细胞裂解液被处理不同量的SDS或100％甲酸，进行过滤试验；c图. 20Q-GFP和97Q-GFP与光诱导的polyQ-Opto聚集体的共聚集；d图. 在有蓝光和无蓝光的条件下，共表达所示蛋白的酵母细胞，经过裂解过滤分析，用抗mCherry和抗GFP抗体进行免疫检测）为了评估的朊蛋白对调节polyQ聚集的影响程度，研究人员通过97Q-Opto pull-down和label-free实验，比较了和细胞中总体蛋白质之间的相互作用以及其中可溶性97Q-Opto的蛋白质组（图6）。他们发现有212个蛋白显著富集在97Q-Opto的酵母细胞中，其中，Rnq1朊蛋白尤其显著富集。这说明Rnq1朊蛋白对调节polyQ聚集有显著的影响。图6. 在细胞中Rnq1与polyQ聚集体相互作用。（a图. 97Q-Opto相互作用组分析；b/c图. 97Q-Opto抗cMyc免疫沉淀后的无标记相互作用组分析的散点图；d图. 在无蓝光或有蓝光的条件下，中可溶性或总体97Q-Opto相互作用蛋白的重叠；e图. 选定的朊蛋白类蛋白质在所示条件下与可溶性97Q-Opto的相互作用蛋白质组中的相对富集的示意图）为了进一步研究Rnq1朊病毒对polyQ聚集的直接影响，研究人员进行了体外聚集实验，发现在Rnq1朊病毒模板上形成了polyQ寡聚化聚集体。由此证实了，Rnq1朊病毒与可溶性polyQ蛋白短暂相互作用，介导polyQ寡聚化聚集体的积累，进而产生下游的生物效应（图7）。图7. 工作模型综上，本文作者通过在酿酒酵母细胞模型中表达内源性朊病毒形成蛋白Rnq1以及不同数量polyQ的亨廷顿舞蹈症蛋白，并引入光诱导蛋白模型，发现只有当内源性朊病毒形成蛋白Rnq1处于淀粉样朊病毒构象时，polyQ的亨廷顿舞蹈症蛋白才会形成聚集体，这一聚集体形成的过程被称为“交叉播种”模型。该研究也反映出，polyQ的聚集和毒性依赖于朊病毒不仅是酵母特有的特性，而且可能反映了一个更普遍的原则，即伴随着年龄增长而产生的一般蛋白质稳态的下降，会在促进polyQ病理聚集和其他与蛋白质聚集相关的神经退行性疾病的发生中起关键作用。https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.09.031文章作者：陈俊霖编辑&推送：柳叶林“