text: 基因工程重组抗体技术的研究进展
  在抗体研究的漫长过程中,相继发展了三代不同水平的抗体制备技术｡其中以抗原免疫高等脊椎动物制备的多克隆抗体,称为第一代抗体;通过杂交瘤技术生产的只针对某一种特定抗原决定簇的单克隆抗体,称为第二代抗体;应用重组DNA技术或是基因突变的方法改造某种抗体基因的编码序列,使之产生出自然界中原本存在的抗体蛋白质分子叫做 ,即第三代抗体｡这种基因工程称为 ｡Kohler等于1975年创立的B淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术,使抗体技术的研究和应用有了重大突破｡该技术已在疾病的研究､诊断､治疗中得到了广泛的应用｡尽管如此,单克隆抗体作为异种蛋白,应用于机体会受到免疫系统的限制,产生强烈的免疫应答｡另外,杂交瘤技术还有许多不足之处,如生产的单抗分子体积过大,与靶抗原的亲和力不够,不同的抗原需要单独接种单抗,细胞融合技术难度高､效率低｡最主要的是,单克隆抗体应用于人体疾病治疗时,使用单抗两周内就会对其产生免疫反应｡这使得传统单克隆抗体技术制备的抗体在应用上受到了极大的制约,无法充分发挥其在疾病防控方面的作用｡因此,基因工程技术及抗体分子遗传学应运而生,并得到了进一步的发展｡在20世纪80年代中期出现新技术将免疫球蛋白的基因结构和功能同DNA重组技术结合起来,再将重组后的免疫球蛋白分子基因导入细胞进行表达｡由该技术所得的抗体去除或减少了无关结构,保留(或增加)了天然抗体的特异性和生物学活性,降低或基本消除抗体的免疫原性,减低抗体中鼠源成分的同时保留原有抗体的特异性｡对现有的优良鼠单抗基因进行改造,所得的抗体人源化程度高,生产工艺简单,廉价易得,且容易获得稀有抗体,临床应用前景广阔｡
  1984年,Morrison等创立了鼠/人嵌合抗体技术,该技术使得基因工程抗体技术得到了进一步的发展｡在第三代抗体中主要包括人源化抗体､小分子抗体､抗体融合蛋白及某些特殊类型抗体等,从一定程度克服了前两代抗体技术的不足｡另外,噬菌体抗体库､核糖体展示文库等的构建使得不经抗原免疫就可获得特异性抗体｡
  1､人源化的基因工程抗体
  人们早期曾尝试用人杂交瘤细胞来生产人单克隆抗体,但是由于人杂交瘤细胞的不稳定性､人单克隆抗体的低亲和力和伦理争议等方面的原因导致该技术很少被应用｡
  1.1､嵌合抗体
  降低鼠源单克隆抗体免疫原性的一种方法是将鼠免疫球蛋白的可变区部分链接到相应的人免疫球蛋白的恒定区,这样就产生了鼠/人嵌合抗体,人源区域在60%~70%｡应用重组DNA技术,将鼠源单抗的可变区基因与人的恒定区基因连接,构建的嵌合基因插入适当的表达质粒,转染相应的细胞后表达｡所产生的嵌合抗体具有结合抗原的功能,同时降低了鼠源单抗的异源性,这样的嵌合抗体在亲和力方面与相应的鼠单抗没有太大的差异,而人对它的免疫反应会有所降低｡但由于其仍然保留了鼠免疫球蛋白可变区的异源性,临床实验证明该嵌合抗体在应用时还会产生人抗嵌合抗体(HACA)可变区的免疫反应｡
  1.2､人化抗体
  为了降低嵌合抗体的免疫原性,使嵌合抗体更加人源化,产生了CDR嫁接技术｡该技术将免疫球蛋白的其他区域都用人免疫球蛋白取代,而仅仅保留鼠免疫球蛋白可变区的CDR部分,这就最大限度地降低鼠源抗体的免疫原性｡这样产生的抗体叫做人化抗体或改形抗体｡这样的操作往往需要复杂的DNA操作,并且有些病人也会产生针对异源CDR的免疫反应｡为了降低这种反应,只有CDR中最具特异性的氨基酸残基部分才能被嫁接到人抗体的骨架部分｡尽管抗体的亲和力主要取决于CDR,但是抗体的其他部分也会对亲和力产生影响｡为了在免疫球蛋白改形后仍然保持原有的亲和力,还需要对免疫球蛋白骨架区进行改进｡
  2､小分子抗体
  为了突破单克隆抗体过大带来的限制,发展了小分子抗体的技术｡这些技术的目标是获得抗体的抗原结合片段(Fab)和抗体的可变区(Fv)｡这样的片段可以通过对抗体的裂解得到,也可以通过扩增免疫球蛋白的相关基因并在细菌内克隆表达而得到｡小分子抗体分子量小､穿透性强､免疫原性低､半衰期短,目前研究较多和比较有实用前景的有以下几种｡
  该技术将重链可变区与轻链可变区用一连接肽连接,并利用原核表达系统表达成一条单链多肽并折叠成由重链､轻链可变区构成的一种新型抗体｡该抗体大小仅为完整IgG的1/6,同时抗原结合位点没有发生变化,因此保留了完整的结合特异性｡基于这一优势,ScFv具有更好的组织穿透力,能够进入一般抗体无法到达的部位,在临床应用及疾病治疗中能够得到更好的应用｡另外,单链抗体拥有多肽接头,可根据需要设计为具有特殊功能的位点,如金属鳌合､连接毒素或药物等,用于影像和临床治疗｡
  2.2､多价抗体
  3､噬菌体抗体技术
  20世纪90年代初,在PCR技术､抗体Fab片段在大肠杆菌中的表达及噬菌体表面呈现技术快速发展的基础上,出现了基于分子生物学方法建立的抗体库技术｡其中,噬菌体抗体库技术表现更为优越｡
  噬菌体抗体(PhAb)技术的基本程序是:用PCR方法扩增全套抗体可变区基因或抗体片段(Fab､Fv或scFv)基因,并与噬菌体衣壳蛋白基因连接后转入载体中,它能够与丝状噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白,将抗体Fab段或单链抗体表达在噬菌体表面,然后通过抗原的亲和筛选从众多的抗体中得到特异性明确的抗体及其编码基因｡该技术绕过细胞杂交环节,不再使用小鼠进行免疫得到抗体,在数周内就能够得到特异的人抗体基因而生产人源化抗体｡用B淋巴细胞全套抗体可变区基因克隆并组装成的噬菌体群体称之为噬菌体抗体库｡根据抗体片段大小的不同,抗体库可分为Fab库､单链抗体(scFv)库､单域抗体库､diabody库､dsFv库和minibody库等｡scFv和单域抗体分子小､穿透力强､体内半衰期短､免疫原性低｡diabody与minibody都是双价抗体,其与抗原的结合能力远高于单链抗体,是较理想的免疫显像和治疗用抗体形式｡
  该技术操作简单､无需细胞杂交或复杂的PCR技术､周期短､花费少;利用不同的抗原可同时筛选几种抗体,并可在百万至亿万个分子中进行选择;适用于抗体､激素､酶､药物､随机多肽等蛋白的制备,更为令人关注的是,该技术能得到由于免疫耐受机制的影响导致免疫动物不能产生的抗体｡噬菌体抗体技术极大地推动了基因工程抗体的发展,它们的产生为人类及动物疾病的预防､诊断和治疗带来了新的希望｡
  4､核糖体展示技术与mRNA展示技术
  核糖体展示技术的关键步骤在于,利用分子生物学技术构建ScFv抗体基因文库,然后转录成mRNA;