text: 肺炎支原体不同检测方法的临床效果分析
  1  前言1.1  研究背景及意义肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP))是一种条件致病菌，是已知又一种能直接引起儿童及成人社区获得性肺炎发作的肺炎病原体，经研究小组发现证明了它可导致1/3的社区获得性肺炎，每个年龄段都有可能被它所感染，但其中，5岁至15岁范围内人群里最为广泛常见并高发，是当前中国小儿呼吸道严重感染主要病因的病原体种类中的一种。肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)是一种体积大小介于正常细菌和病毒之间的一种病原微生物，无完整的细胞壁结构(胞壁质缺陷)，仅有一层细胞膜结构就可进行自我分裂复制的体积最小的原核细胞型微生物[1]。该病原体存在的唯一宿主生物就是我们人类，肺炎支原体肺炎是一种传染性疾病，它是由人体呼吸道内直接传播而来，在与人有密切的接触后，可以通过呼吸道和空气中的飞沫进行传播。由上呼吸道传入人体，接着被吸附在呼吸道黏膜上，人与人的接触会加速它的扩散，在感染后的早期症状是持续性的乏力、咳嗽、咽喉疼痛、发烧、头疼等[2]。由于症状与流感相似，容易造成误诊与漏诊，因此，肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)感染的早期病原学诊断非常重要。随着病情的加重，可引发各种并发症，累及全身其他器官。它的致病机制并未完全明确，主要考虑黏附作用、细胞毒性作用、细胞免疫、体液免疫、多脏器损伤的机制等。在药物治疗的方面，对作用于细胞壁的抗生素对其无疗效，因此使用抗感染的敏感抗生素对其进行治疗，如四环素类(多西环素)、大环内酯类(包括红霉素、阿奇霉素、罗红霉素、克拉霉素等)、呼吸喹诺酮类(左氧氟沙星、莫西沙星等)[3]。阿奇霉素为治疗的首选药物[4]，近年来肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)对大环内酯类药物的耐药菌株水平仍然普遍呈现为中高水平耐药趋势[5]，原因大多为：此类药物作用导致肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)感染后退热时间的延缓和药物抗感染作用疗程相对延长，一些严重患者可因未病情未能够得到及时有效的治疗措施而逐步进展转变为急重症肺炎，甚至会危及其生命[6]。肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)感染的患者，其血清中免疫球蛋白，如IgM、IgG、IgA等均可显著增加，且在一定程度上保持不变，故检测其抗体含量对肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)感染的诊断意义重大。其常用检查方法主要有：培养法、血清学方法、聚合酶链反应等[3]。xxx医院检验科免疫室采用被动凝集法(passive agglutination method，PA)与间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，IFA))检测肺炎支原体抗体，本文通过收集该医院的检验结果数据，进行简要准确的对比分析，探讨上述两种方法各自及联合使用的临床使用价值，为医院临床诊断疾病提供一些更加全面且有利实用的检测诊断价值，做到疾病真正的临床早诊断与早治疗。1.2  国内外研究现状（1）国内研究现状王军（2019）等通过对肺炎支原体感染的临床样本进行PCR检测，结果表明PCR方法具有高灵敏度和特异性，能够快速、准确地诊断肺炎支原体感染。杨勇（2020）等研究了肺炎支原体快速诊断试剂盒的临床应用价值，发现该试剂盒具有高灵敏度和特异性，能够在短时间内迅速诊断肺炎支原体感染，并指导临床治疗。赵文静（2021）等采用血清学检查法对肺炎支原体感染进行诊断，结果显示该方法具有较高的灵敏度和特异性，能够较为准确地判断患者是否感染肺炎支原体。霍卓君（2018）等对比了PCR和传统培养法在肺炎支原体检测方面的效果，结果表明PCR方法更为敏感和准确，能够快速、准确地检测出肺炎支原体感染。各种肺炎支原体检测方法各有优劣，临床医生应根据具体情况选择合适的检测方法。PCR方法在快速、准确诊断方面表现较为突出，但设备要求高；快速诊断试剂盒能够在短时间内快速诊断，并可与传统培养法结合使用提高准确性；而血清学检查法则更多用于对慢性感染的检测和监测。（2）国外研究现状Chen et al. (2018) 比较了PCR和传统培养法在肺炎支原体检测中的效能，结果表明PCR方法具有更高的灵敏度和特异性，且可以更快地进行检测。Waites and Talkington (2004) 对肺炎支原体检测的各种方法进行了总结。在分子生物学技术方面，PCR和核酸杂交法是目前最常用的方法；而免疫学方法则包括酶联免疫吸附试验、荧光抗体等技术。Xue et al. (2019) 研究了肺炎支原体快速诊断试剂盒的临床应用情况。研究发现，该试剂盒有较高的灵敏度和特异性，在快速诊断方面具有一定优势。Harris et al. (2015) 进行了对比试验，比较了PCR、传统培养法和荧光抗体等方法在肺炎支原体检测中的效果。结果表明，PCR方法具有更高的灵敏度和特异性，能够更准确地检测出肺炎支原体感染。综合来看，国外对于肺炎支原体检测方法的研究也比较丰富，与国内类似，PCR技术在肺炎支原体检测中占据重要地位，快速诊断试剂盒也具有一定优势。此外，免疫学方法也被广泛应用。2  资料与方法2.1 一般资料搜集xxx医院2021年8月1日~2021年12月8日在本院就诊的门诊病人和住院病人中同时采用PA法与间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)法检测血清中肺炎支原体抗体的患者标本，共200例，作为此次的研究对象。其中男性患者102例(51%)，女性患者98例(49%)。患者年龄为10天15时~91岁8月。年龄分布特点为小儿患者居多，有少数的老年患者与极少数的中年患者。2.2  纳入标准与排除标准纳入标准：2021年8月1日~2021年12月8日期间在xxx医院就诊的门诊或住院患者；患者血清中同时采用PA法与间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)法检测肺炎支原体抗体；年龄在10天15时~91岁8月之间。排除标准：患者未接受PA法和间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)法检测；患者年龄不在10天15时~91岁8月之间；患者因其他疾病合并进行肺炎支原体抗体检测；患者无完整临床资料。2.3  研究方法2.3.1 检测试剂(1)PA法选取的是日本富士瑞必欧株石会社所供应的肺炎支原体抗体检测试剂盒。此诊断试剂主要为体外检测血清肺炎支原体抗体水平的一种诊断性试验。检测的是其IgM和IgG的总抗体。检验结果由科室老师肉眼观察凝集现象并判读结果。(2)间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)法选用欧蒙医学实验诊断股份公司所供应的呼吸道病原体谱抗体IgM检测试剂盒(主要组成成分：生物载片、异硫氰酸荧光素标记的羊抗人IgM抗体、磷酸盐、吐温20、封片介质、盖玻片等)。该检测试剂产品主要用于体外直接快速定性，检测人血清或者血浆中各种常见呼吸道病原体特异性表达的特异性IgM抗体，其中包括了快速检测出肺炎支原体。检验结果由科室老师在荧光显微镜下阅片并判断结果。2.3.2  仪器设备欧蒙之星荧光显微镜、水浴箱、离心机、平板混合器2.3.3  具体方法所有用于研究对象的血清标本均同时采用PA法与间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)法进行联合检测。操作者均严格认真按照本试剂盒要求及有关设备说明书内容进行上述实验操作。(1)PA法的操作步骤为：①每个样品占一横行四个小孔，第一小孔加100μl稀释液，其余三小孔每孔加25μl稀释液。②将25μl的待检测血清加入到第一小孔中，接着使用25μl移液器依次倍比稀释至第四孔，弃去最后25μl。③吸取未致敏粒子25μl加到第二小孔中，余下两孔加入致敏粒子25μl。④振荡混匀后放于25℃恒温水浴箱静置2小时读取结果。PA法结果判读：严格按照说明书判定，首先读取反应图像：根据颗粒是否聚集以及聚集之后粒子环的呈现情况来读取阴阳性。其判定标准为：滴度值1：40者即认定为反应阳性，抗体滴度为最终稀释倍数所显示反应图像为(+)时。(2)间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)法的操作步骤为：①配制PBS吐温缓冲液：将一包磷酸盐溶于一升蒸馏水中，再加入2mL的吐温20，搅拌混匀；②准备两排试管，一个加180μl试剂盒自带的稀释液，并编号，另一个加180μl的PBS；③在加了稀释液的试管里加20μl的血清混匀，2500r/min离心5分钟；④吸取25μl的上清液到反应板的前三个反应区，再吸取25μl上清液到PBS里，混匀后加25μl到第四个反应区，盖上生物载片，25℃温浴30min；⑤洗板：用PBS缓慢冲洗并浸泡5min；⑥在反应板上加25μl的酶25℃温浴30min；⑦洗板：用PBS缓慢冲洗并浸泡5min；⑧封片：将盖玻片置于加样板上，滴加一小滴甘油，把生物载片置于其上。⑨在专用荧光显微镜下观察特异性的荧光模型。间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)定性鉴别结果的判读：在实验室所推荐的血清稀释度范围内，出现特异性荧光，则即可判定其为血清相应抗体阳性，如若未出现特异性荧光，则判定其为血清相应抗体阴性。2.3.4  观察指标仔细观察两种检测方法阳性检出率与阳性符合率，进行结果的对比分析。2.3.5  统计学处理统计学软件SPSS 22.0处理分析数据。计数资料分别采用的是例数和百分率，两种检测方法间数据的差异性采用的是配对χ2检验，两种检测方法的一致性联合采用了Kappa检验。当P＜0.05时表示为统计学差异有一定的意义。3  结果3.1  两种不同方法检测肺炎支原体抗体阳性率比较PA检出的阳性例数为112例，阳性检出率为：112/200=56.00%。阴性例数为88例，阴性检出率为：88/200=44.00%。间接免疫荧光法(间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，IFA))检出的阳性例数为102例，阳性检出率为：102/200=51.00%。阴性例数为98例，阴性检出率为：98/200=49.00%。结果显示：阳性检出率PA明显高于间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)。同时采用这两种方法检测肺炎支原体抗体，其阳性检出率可达(97+15+5)/200=58.50%，阳性检出率明显要高于只采用任意一种方法。差异有统计学意义(χ2=4.05，P＜0.05)，见表3-1。表3-1 不同方法肺炎支原体抗体检测结果表3.2  两种不同方法检测肺炎支原体抗体的一致性分析PA阳性而间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)阴性的有9例；PA阴性而间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)阳性的有5例。两种检测方法的阳性符合率(敏感度)为：97/102=95.10%，阴性符合率(特异性)为：83/98=84.69%。总符合率(实际一致率)为：(97+83)/200=85.00%。采用Kappa检验，Kappa=0.799，大于0.75，具有高度一致性，见表3-2、3-3。表3-2 间接免疫荧光法(IFA)检测肺炎支原体(MP)抗体结果(n)表3-3 间接免疫荧光法(IFA)检测肺炎支原体(MP)抗体结果(n)3.3年龄的影响将200例研究对象按年龄分为婴幼儿组(&lt;3岁)48例；儿童组(4~6岁)85例；少年组(7~18岁)61例；及中老年组(＞35岁)6例。同时使用上述两种方法检测肺炎支原体抗体，其阳性检出率，婴幼儿组为39.58%(19/48)，儿童组为72.94%(62/85)，少年组为57.38%(35/61)，中老年组为33.33%(2/6)。结果为4~6岁儿童肺炎支原体抗体阳性检出率最高，其次为少年组，＞35岁的中老年患者最低。表3-4 年龄分组肺炎支原体抗体检测结果3.4性别的影响将此次的研究对象根据性别分组，男性患者102例，女性患者98例。同时使用上述两种方法检测肺炎支原体抗体，其中阳性检出率男性患者为51.96%(53/102)，女性患者为48.98%(48/98)。表3-5 性别分组肺炎支原体抗体检测结果4  讨论4.1肺炎支原体感染的危害及其诊断与治疗呼吸道内感染性疾病是各种儿科疾病发生中较为广泛常见的一种呼吸系统疾病，分为了上呼吸道直接感染与慢性下呼吸道继发感染，上呼吸道感染通常会导致感冒、急性咽炎、发热等，而下呼吸道内感染最易引发呼吸系统疾病，为急慢性支气管扩张、急慢性细支气管炎等[7]。肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)是近年来引起儿童呼吸道系统疾病流行的几个最普遍常见的肺炎病原体之一。致病的前提条件为：通过侵入上呼吸道进入正常人体，对人体气管、支气管肺泡和细支气管表面的上皮细胞进行吸附寄生，从而破坏呼吸道和气道粘膜的完整性[8]，除了能自发引起急慢性上呼吸道继发感染外，还能引起肺部感染，其并发症也有众多。常见的症状有：发热、头痛、咳嗽、乏力、肌肉痛及一些胃肠道的症状[9]，无特异的临床症状，不易与其他呼吸道病原致病菌区分[10]，易造成误诊与漏诊。而且发病率逐年升高，对儿童的身心健康构成了极大的威胁[8]。肺炎支原体感染的人发病后能直接造成受感染宿主细胞系统上的一系列直接性功能损害，如体液和免疫生理机能长期的急慢性衰竭损害、细胞系统内的免疫系统机能的急性长期慢性损害、自身免疫调节系统免疫能力长期的持续严重失调损害、免疫反应细胞大量蓄积、免疫细胞过程被抑制、免疫应答细胞发生逃避排斥作用损害等，因此它不仅直接感染造成对宿主呼吸系统细胞的慢性损害，还能进一步发展引起多种其他肺外异常表现，如神经系统、血液系统、心血管系统、消化系统、泌尿生殖系统、血液系统、皮肤与关节等多个系统的损害[11]。这些严重或肺外表现可能是由于过度的免疫反应或丰富的细菌负荷[12]。因此，准确诊断肺炎支原体感染，可及时正确指导临床用药，避免抗生素的滥用，对于患者的治疗以及预后十分重要。4.2肺炎支原体感染的临床检测方法(1)影像学方法：在常见肺部急慢性感染疾患的鉴别诊治检查中同样发挥了着许多不可被忽视的治疗作用，最为临床常见用的两种方法为胸腔CT片检查和支气管X线检查，前者检查的分辨率度及临床定性的诊断率度均大大高于了后者，但又因肺炎支原体肺炎时的临床影像学症状表现又较为特殊复杂[13],因此只能为诊断肺炎支原体肺炎提高参考；(2)血常规和C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)：与正常人相比值略有升高，CRP反映了肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)感染引起的急性严重全身炎症反应，提示免疫系统发育良好，CRP是一种特异性炎症标记物，当出现强烈的免疫反应时，CRP升高，这对判断疾病的严重程度起到了迅速的作用。(3)分离培养：为当前确诊肺炎支原体感染的最经济可靠高效的确诊方法没有之一(金标准)，但支原体由于其不易纯化培养，且所需要培养时间长，限制了临床应用，不适用于临床诊断的早期快速准确诊断治疗，但近年来，随着科学技术的发展，液体培养基快速检测肺炎支原体的方法被运用于临床检测中，该方法操作简便、结果准确，因此，在临床培养法的检测中得到了应用[14]；(4)聚合酶链法：该检测方法灵敏度极高(可达20CFU／5μL)[15],耗时又比较比较短，敏感性和特异性亦都极高，可主要用于对肺炎支原体感染患者的临床早期诊断，但阳性结果无法区分病情的进展阶段，且对操作过程要求较高，容易污染，成本较高，价格昂贵[3]。(5)血清学试验：为目前检测肺炎支原体的主要手段，检测使用的技术是测定肺炎支原体抗体，包括直接被动凝集法、间接免疫荧光法、酶联免疫吸附试验等，其中，酶联免疫吸附试验为目前诊断肺炎支原体感染最可靠的方法。目前国内肺炎支原体研究探讨的学术热点问题为：从病原分子机制及相关基因的角度去研究肺炎支原体其致病的机制以及耐药发生机制[16]。当前，血清学试验为实验室的主要方法。xxx医院检验科免疫室主要采用被动凝集法与间接免疫荧光法对其进行检测。4.3两种肺炎支原体检测方法的比较分析PA的试剂盒材料采用由专门针对肺炎支原体的细胞膜成分致敏人工明胶粒子原料进行制作及封装制备而成，其试验检测的基本原理是为：人血清中具有的肺炎支原体抗体与致敏粒子接触后，发生反应，产生特异性凝集的现象。共同检测IgM和IgG的总抗体。间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)的检测试剂盒不仅检测肺炎支原体，而且还用于检测一些抗常见呼吸道病原体的IgM抗体，其检测原理为：将稀释后的血清与涂有检测抗体的载体进行温浴，若样本呈阳性，IgM抗体就会与对应的抗原直接结合，在第二阶段的温浴中，经结合的抗体则与荧光素标记的抗人免疫球蛋白抗体发生反应，荧光模型可在荧光显微镜下观察到。结果阳性时，肺炎支原体在生物薄片上呈网状荧光。两种检测方法进行综合比较分析，PA法检测出来的是IgM和IgG的总抗体，而间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)法检测出来的仅仅只有IgM抗体。本文研究主要结果均显示，PA法阳性检出率较间接免疫荧光法要高，因此检测灵敏度也较高，间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)法的检测特异度较高。两者联合检测可提高肺炎支原体抗体的阳性检出率。两者分别对于肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)感染性疾病的临床早期诊断均有很重要的价值。4.4肺炎支原体感染的免疫球蛋白检测及季节性分析感染肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)后，不同的免疫球蛋白出现的时间会有所不同。人类机体在感染肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)后至少有一周的潜伏期，才可能会开始出现血清特异性IgM类抗体，15~30天左右的时间会达高峰，随后可呈缓慢性的逐渐下降趋势，持续时间一般不太长，紧接着机体出现的是血清特异性IgG抗体，在人体被感染肺炎支原体后就可呈逐渐稳定缓慢地升高，一般持续的时间会比较长。一般情况下，如若血清样本中发现有特异性IgM抗体阳性时，则提示为肺炎支原体早期感染，如若血清样本中只存在有IgG抗体阳性时，则提示为既往感染，当IgG及IgM同时检测为阳性时，则提示为初次感染或现症感染[17]，且随时有感染和复发的风险。肺炎支原体的感染在性别上并没有太大的区别，对于不同年龄段的感染，儿童为易感人群。因为儿童的呼吸系统和心血管系统等都在发育阶段，未完全发育成熟，因此在感染了肺炎支原体后，对于一些肺外的并发症较易发生[13]。但结果显示婴幼儿组的阳性检出率较儿童组的阳性检出率低，原因主要为：虽然两类人群免疫力比较低下，但由于肺炎支原体主要经过飞沫传播，而儿童组因为有活动的能力，接触的人群较多，活动的范围较大。因此比较容易造成肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)的感染。肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)的感染在季节上有所差别，秋冬季的发病率较高，但由于在夏季和秋季小儿抵抗力较弱，季节防治的重心应该偏向夏季和秋季[2]。与气候也有很大的关系，如温度、湿度等，平均温度和湿度越高，肺炎支原体感染的几率就越高。5  结论本研究通过比较两种不同的肺炎支原体抗体检测方法，探讨其在临床诊断中的应用价值。结果表明，荧光免疫分析法具有更高的阳性检出率和一致性，可以作为肺炎支原体抗体检测的一种有效方法。此外，年龄和性别对检测结果有一定影响，需要在临床应用中加以注意。在实际临床工作中，肺炎支原体感染是一种常见的呼吸道疾病，对于患者的及时诊断和治疗非常重要。传统的肺炎支原体抗体检测方法存在一定的局限性，如操作复杂、时间较长等。而荧光免疫分析法则具有快速、准确、简便等优点，被广泛应用于临床诊断中。因此，本研究的结果为临床医生提供了一种新的肺炎支原体抗体检测方法，有助于提高诊断的准确性和效率。同时，本研究还发现年龄和性别对肺炎支原体抗体检测结果有一定影响。老年人和女性更容易感染肺炎支原体，因此在进行肺炎支原体抗体检测时需要考虑这些因素。此外，男性和女性的肺炎支原体抗体阳性率也有所不同，这也需要在临床应用中加以注意。总之，本研究通过比较两种不同的肺炎支原体抗体检测方法，探讨了其在临床诊断中的应用价值。结果表明，荧光免疫分析法具有更高的阳性检出率和一致性，可以作为肺炎支原体抗体检测的一种有效方法。同时，年龄和性别等因素也会影响肺炎支原体抗体检测结果，需要在临床应用中加以注意。