text: BRD4 抑制剂抗肿瘤机制研究进展
  肿瘤药学 2019
  吴芳，张永昌，李坤艳，衡建福，杨农
  南华大学湖南省肿瘤医院
  BRD4 蛋白是溴结构域和超末端家族蛋白（BET）家族中最重要的功能蛋白，含两个溴结构域及一个超末端结构域。
  BRD4 的表达上调与肺癌、乳腺癌、急性髓系淋巴瘤、肝癌等多种肿瘤的发生发展密切相关。
  针对BRD4 已开发出多种抑制剂，且其单药或联合其它肿瘤抑制剂应用均显现出良好的抗肿瘤作用。
  BRD4 抑制剂在不同的肿瘤中作用机制不同，本文主要就BRD4 抑制剂在不同类型肿瘤中的抗肿瘤机制研究现状进行综述。
  肿瘤；BRD4；BETi
  研究显示多种肿瘤的发生发展与BRD4 的功能紊乱密切相关，针对BRD4 靶点已经开发出十余种抑制剂，并在多种肿瘤的基础研究和初步临床试验中展现出良好的抗肿瘤作用。
  本文主要就BRD4 在肿瘤发生中的作用及其抑制剂抗肿瘤作用的机制展开阐述。
  BRD4 的结构和功能
  BRD4 位于染色体19p13.1 区，是编码超末端家族蛋白（bromodomain and extraterminal domain，BET）家族最重要的功能蛋白，结合在核小体组蛋白或非组蛋白如NFκB、p65 蛋白/RelA、细胞周期蛋白T1、Twist 和CATA1 以及与特定染色质调节因子相互作用的超末端结构域。
  BRD4 含有两个串联溴结构域模块，参与乙酰赖氨酸识别，将BRD4连接到染色质上。
  BRD4 既是染色质阅读蛋白，也是转录共激活因子，可直接或间接结合转录，促进RNA 聚合酶II（Pol II）激活下游的作用。
  研究显示BRD4 通过招募正向转录延长因子（PTEFb）激活C-MYC、C-JUN 等调控细胞增殖与凋亡，在肿瘤发生、发展以及肿瘤细胞的浸润和转移等过程都发挥重要作用［1］。
  多种恶性肿瘤如肺癌、乳腺癌、血液系统肿瘤以及肝癌等的发生发展均与BRD4 功能紊乱有关。
  BRD4 在肿瘤发生中的作用
  最近研究表明［2］，BRD4 在癌症中的相关性超出了在转录调控中的作用，且将该蛋白质鉴定为基因组稳定性的保持者。
  BRD4 不仅在转录调控中发挥作用，还可以控制DNA 损伤检查点激活、修复并维持端粒，发挥转录之外的作用。
  BRD4 作为组蛋白阅读者，在高乙酰化和转录倾向的染色质区域（包括启动子和ENH）积累，并且作为大蛋白复合物组装的成核中心，促进RNAPolII活性，刺激转录起始和延伸，此功能在很大程度上依赖于BRD4 的BD 和它们识别乙酰基蛋白的能力［3-4］。
  BRD4 与超乙酰化染色质区域结合，募集Mediator 复合物，促进大转录调节蛋白的组装，形成SE 和启动子之间的桥梁，有利于稳定RNAPolII的结合。
  BRD4 还可激活P-TEFb，刺激RNAPolII转变为活性延伸。
  BETi 与乙酰化残基竞争结合BRD4 溴结构域，从染色质中释放BRD4 并分解SE 与启动子之间的相互作用，降低RNA-PolII 通量并阻断关键癌基因的转录［5］。
  BRD4 在DNA 双链断裂（DSBs）修复中也发挥着重要作用。
  H4 乙酰化（H4Ac）和H2AX 磷酸化（γH2AX）在DSB 处累积，引发BRD4 募集［6］。
  BRD4 促进并稳定P53 结合蛋白（53BP1）的相互作用，53BP1 又作为DNA 修复组装和激活的适配器［7-8］。
  BETi 与乙酰化残基竞争性结合BRD4 的溴结构域，从DSB 释放BRD4，使DNA 修复机制不稳定并诱导DNA 改变积累直至细胞死亡［9］。
  BRD4对DNA 修复的作用表明BETi 和DNA 损伤剂（如辐射或铂类疗法）或DDR 特异性抑制剂可能具有协同作用。
  端粒可通过缩短细胞有丝分裂来诱导体细胞衰老，并在其极短时诱导细胞凋亡。
  因此，端粒的长度可以控制细胞的增殖速度，端粒的异常延长和端粒酶的表达与活性变化都可改变肿瘤的侵袭性。
  尽管BRD4 与端粒延伸的协同作用机制尚不明确，但有报告强调了 BRD4 在癌症异常端粒调节中可能存在的作用［2］。
  增强组蛋白乙酰化和H2AX 磷酸化在端粒上的积累，促进BRD4 结合，进而促进端粒保护复合物的组装并促进端粒酶的活性。
  由于翻译后修饰在端粒复合物调节中起基本作用，因此BRD4 的激酶或乙酰转移酶功能可能参与了该过程。
  例如，BRD4 可进一步促进端粒区域中组蛋白的乙酰化，乙酰化组蛋白反过来促进端粒延长。
  此外，BRD4 还可直接影响端粒酶或端粒保护复合物相关蛋白质的乙酰化或磷酸化，从而促进其活性。
  BETi 与乙酰化组蛋白可竞争性结合BRD4 的溴结构域，从短端粒释放BRD4，使端粒保护复合物组织不稳定并降低端粒酶活性［2］。
  端粒的逐渐缩短可导致癌细胞衰老或凋亡［10-11］。
  BRD4 抑制剂
  鉴于BRD4 在肿瘤中的重要作用，科学家通过药物辅助设计研发了多种BRD4 抑制剂。
  目前，已报道的靶向BRD4 结构域小分子抑制剂主要包括异噁唑类、嘌呤类、喹啉酮类、四氢喹啉类、萘啶类、乙酰化赖氨酸类似物等，如JQ1、I-BET 和MS4417等对BET 溴结构域具有高亲和力与特异性。
  BRD4小分子抑制剂与乙酰基- 赖氨酸竞争性结合到溴结构域，导致BRD4 或BET 蛋白的释放。
  其中，研究最多的BET 抑制剂是JQ1，也是最早公开报道的BET 家族抑制剂，可通过抑制BD1 及BD2 来抑制BRD4 的活性［12］。
  JQ1 和BRD4 的共结晶结果也显示JQ1 可与BRD4 结合，但由于JQ1 的半衰期较短，需要大剂量给药才能维持疗效，这也增加了药物的毒副作用。
  因此，目前JQ1 主要用于工具药或联合辅助用药。
  为了解决JQ1 半衰期较短的问题，研究者对JQ1 进行基团改造，获得了 OTX015、MS417、CPI203、BET-BAY-002 等小分子化合物。
  这些小分子化合物细胞实验的IC50 值也达到10 nM 以下，半衰期有所延长，但目前尚无相关临床研究数据报道。
  此外，喹啉酮类BI2536、异唑类I-BET151、四氢喹啉类I-BET726 以及双靶点抑制剂870 等化合物在抑制多种BRD4 高表达的肿瘤细胞实验中均展现出较好的效果，多项相关临床试验也正在开展中。
  2010 年，Zuber J 等在《Nature》上首次报道了BRD4 在急性髓性白血病中表达上调［13］。
  2013 年，Loven J 等在《Cell》上报道多种多发性骨髓瘤细胞株中BRD4 表达上调［14］。
  2016 年，Shu S 等发现BET 抑制剂对三阴性乳腺癌具有显著的抗肿瘤活性［15］；抑制BRD4 可诱导AML 细胞凋亡［13］；2018年，Gao Z 等在《Cancer Biol Ther》上报道通过靶向BRD4 蛋白下调elF4E 可抑制NSCLC 的生长［16］。
  BRD4 小分子抑制剂，无论是单药或联合使用，在上述肿瘤体内或体外实验中均展示出较好的抗肿瘤活性。
  肺癌的发生率和死亡率在所有恶性肿瘤中居首位［17］，小细胞肺癌（SCLC）是一种高度恶性肿瘤，约占原发性肺癌的15%，且多数患者在发现时已失去手术机会。
  Liu 等研究发现SCLC 中TP53 和RB1 的频繁失活以及组蛋白异常修饰，表明转录和表观遗传调控在SCLC的进展中起着重要作用［18］。
  多项研究显示BRD4在SCLC 和肺腺癌中发挥着重要作用。
  研究者使用BET 抑制剂JQ1 和难治复发性SCLC 异种移植瘤模型，靶向550 个表观遗传基因的shRNA 文库，进行综合性致死筛选，结果显示，HDAC6 是与JQ1 组合的致死性靶基因。
  在人和小鼠SCLC 细胞系的异种移植瘤中，HDAC6 抑制剂ACY-1215 联合JQ1 可显著抑制肿瘤生长［18］。
  这种效应在NK 细胞耗尽时被消除，表明这些先天免疫淋巴细胞在SCLC 的治疗中发挥着作用。
  由此推测，在SCLC 临床前模型中，NK 细胞介导了HDAC6和BET 抑制剂联合抗肿瘤的协同作用。
  Lloyd T 等的研究表明，溴结构抑制剂ABBV-075 可通过上调促凋亡蛋白，下调抗凋亡蛋白BCL2 和BCLxl，与BCL2 抑制剂产生协同作用诱导SCLC 细胞凋亡［19］。
  此外，ABBV-075 的抑制作用增强了BCL2-BIM 复合物的作用，从而引起细胞凋亡，且二者的协同作用与BCL2 表达呈正相关，这一发现为BET 和BCL2 抑制剂治疗BCL2 高表达肿瘤提供了理论依据。
  有研究者认为，SCLC 中c-Myc 是JQ1 作用的功能靶标，c-Myc 作为原癌基因，在细胞增殖、转移及凋亡过程中起关键作用［20］；也有研究显示，BRD4与c-Myc 在晚期SCLC 中一致高表达且与预后较差相关。
  Suda K 等发现，c-MycmRNA 及蛋白在超过30% 的SCLC 细胞系中高表达，抑制c-Myc 可有效抑制SCLC 细胞增殖，并促进其凋亡［24］。
  JQ1 处理SCLC 细胞荷瘤裸鼠，可以观察到明显的抗肿瘤效果。
  Adeegbe 等发现在KRAS 突变的肺腺癌患者中，溴结构域抑制与PD-1 抗体有协同抗肿瘤作用［25］。
  研究采用KRAS+/LSL-G12D、Trp53L/L（KP）NSCLC 小鼠模型，用JQ1 与PD-1 抗体处理小鼠，发现调节性T 细胞（Tregs）数量减少和肿瘤浸润性T 细胞被激活，PD-1 在肿瘤浸润性T 细胞上的表达增加。
  在肺癌小鼠模型中，这种联合治疗比任何一种单药治疗表现出更强大和持久的抗肿瘤效应，且小鼠整体存活率更高。
  Shimamura 等发现，在KRAS突变LKB1 野生型NSCLC 中，JQ1 可减弱Myc 的表达且影响其转录功能；JQ1 治疗KRAS 突变的NSCLC 小鼠，可使肿瘤明显消退［26］。
  也有报道称，BET 溴结构域抑制剂JQ1 可通过上调P21 来增加NSCLC 的放疗敏感性［27］。
  这些研究阐述了BRD4在肺癌中的作用机制，为BET 抑制剂治疗肺癌提供了前期理论依据。
  近年来，乳腺癌已成为全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，是女性发病率最高的肿瘤。
  乳腺癌分为Luminal A 型、LuminalB 型、人类表皮生长因子受体2（humanepidermal growth factor receptor-2，HER-2）阳性和三阴性（triple-negative breast cancer，TNBC）四种类型。
  三阴性乳腺癌缺乏针对性治疗，仍然具有挑战性。
  有研究发现BRD4 或BRD4 相关通路在小鼠和人乳腺癌的发生发展中发挥重要的作用［28］。
  BET抑制剂在人三阴性乳腺癌的鼠异种移植模型中显示出很强的抗肿瘤活性，其作用机制主要与BCLXL、Jagged1/Notch1 相关。
  以往研究表明，BET 抑制剂可抑制BCL-2 或BCL-XL 表达，而研究者发现MCL1 也是抗细胞凋亡BCL-2 的成员。
  BAI 等研究发现，用第二代BET抑制剂BET-246 处理人TNBC 细胞1 h 后，发现BET 转录因子被降解，细胞生长被抑制且出现凋亡［29］。
  在体内、外的TNBC 细胞中，通过siRNA 沉默MCLL，极大地增强了BET 抑制剂的诱导凋亡作用；而过表达MCLL 则显著降低了BET 抑制剂的诱导凋亡作用，说明MCLL 是BET 抑制剂诱导TNBC凋亡的关键靶点。
  Andrieu G 等报道，在三阴性乳腺癌患者中，BRD4 可调节配体/ 受体Jagged1/Notch1的表达与信号传导，且BRD4 和Jagged1 表达与TNBC 的远处转移呈正相关，选择性敲除BRD4 可抑制Notch1 活性并抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭［28］。
  研究发现，BRD4 可与AMPK 相互作用，引起自噬相关蛋白AMP 活化蛋白激酶（AMPK）在乳腺癌中的下调，BRD4 抑制剂可诱导AMPK 调节自噬相关细胞凋亡［30］。
  研究者设计了一种BRD4 小分子抑制剂9f（FL-411），在乳腺癌细胞中9f 可通过阻断BRD4-AMPK 相互作用，激活 AMPK-mTORULK1调节的自噬途径，从而诱导ATG5 依赖性自噬相关细胞凋亡（ACD）。
  也有研究者发现，hsamiR-599（抑制性miRNA）在乳腺癌组织和细胞系中下调，其过表达则可抑制细胞的存活与增殖［31］。
  通过进一步实验证明，BRD4 是hsa-miR-599 的直接靶点，hsa-miR-599 通过靶向BRD4 来抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，增加BRD4 表达可部分逆转hsamiR-599 的抑制作用。
  以上研究表明，BRD4 在乳腺癌的发生发展及肿瘤细胞的增殖与凋亡、迁移与侵袭过程中发挥着密切的作用，为TNBC 的靶向治疗提供了理论依据。
  急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）是一类具有高度异质性的造血系统恶性肿瘤。
  通常是由调节染色质和转录的遗传机制发生改变，从而阻断细胞分化引起，以骨髓、血液和其他器官中恶性增殖和原始粒细胞增多为特征。
  这些发病机制使白血病细胞更易受到转录调节因子的干扰，如靶向共激活蛋白BRD4 小分子。
  BRD4 在AML 细胞中的转录功能逐渐被发现，大量研究证明BRD4 作为一种表观遗传调节因子，是AML 不同亚型的治疗靶点，特别是MLL-AML。
  早在2011 年，Tony Kouzarides 等在《Nature》报道转录过程的异常是诱发MLL-AML 的主要原因，从染色质中置换BET 蛋白可治疗MLL-AML［32］。
  许多MLL 融合癌蛋白是调节转录延伸有关的超级延伸复合物（SEC）家族成员。
  研究者通过筛选AML 核裂解物中一系列蛋白质组发现，MLL 融合体与BET 家族有关。
  研究者发现BET 家族的新型小分子抑制剂GSK1210151A（I-BET151）通过诱导早期细胞周期阻滞和凋亡，对人和小鼠MLL-AML细胞系均具有显著抑制作用。
  其作用方式是通过从染色质中置换BRD3/4、PAFc 和SEC，从而部分抑制关键基因BCL2、C-MYC 和CDK6 的转录。
  在体内外，BET 小分子抑制剂JQ1 可通过抑制BRD4发挥稳定的抗白血病作用，包括终末骨髓分化和白血病干细胞的消除。
  这些研究推动了BET 抑制剂I-BET 在MLL-AML 的各种临床前模型中的评价。
  Stewart HJ 等发现BRD4 溴结构域抑制剂JQ1对p53 野生型OCI-AML3 细胞系具有高活性，该细胞系携带与贫血相关的核磷蛋白（NPM1）和DNA甲基转移酶3（DNMT3A）基因突变［33］。
  研究者发现在这些细胞中，JQ1 引起caspase 3/7 介导的细胞凋亡和DNA 损伤反应。
  在联合治疗研究中，研究者还发现组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂、HDM2抑制剂Nutlin-3 和蒽环类多柔比星均可增强JQ1作用的细胞凋亡反应。
  这些化合物均诱导p53 的活化，表明JQ1 可使AML 细胞对p53 介导的细胞凋亡敏感。
  用JQ1 阻止BRD4 介导的p53 向染色质靶标募集，接着p53 在OCI-AML3 细胞中被激活，以c-Myc 非依赖性方式导致细胞周期停滞和凋亡。
  研究称，BRD4 与DNMT3A 突变的AML 中p53 相关，且JQ1 可引起AML 细胞凋亡。
  也有研究者认为，BRD4 在AMLL 中的作用与自噬基因和Keap1 的表达、AMPK-ULK1 介导的自噬相关［34-35］。
  这些研究表明BET 蛋白作可为AML 的治疗靶点，并为早期临床试验中作为AML 治疗的BET 抑制剂的评估奠定了基础。
  肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的原发性肝恶性肿瘤，其发病率居全球第五，死亡率排名第二，预后差是其相关死亡的主要原因。
  然而HCC发生的潜在机制目前尚不明确。
  Li GQ 等研究发现，BRD4 在HCC 组织中呈过表达，使用BRD4 抑制剂JQ1，可抑制HCC 细胞生长并诱导其凋亡，同时还能减缓小鼠中HCC 异种移植瘤的生长［36］。
  JQ1 不仅通过抑制Myc 表达诱导G1 细胞周期停滞，导致CNKN1B（P27）上调，还能阻遏促凋亡蛋白BCL2L11（BIM）的表达。
  此外，通过siRNA 敲除BIM，可减弱JQ1 诱导的HCC 细胞凋亡。
  Zhang P 等研究发现，BRD4 在HCC 组织中显著上调，其过表达与HCC 进展相关，且参与HCC 细胞的生长和体外侵袭［37］。
  BRD4 过表达可诱导HCC 细胞上皮- 间质转化（EMT）表型，BRD4shRNA 在体内可显著抑制HCC 细胞增殖。
  He L 等鉴定了一种新型抗BRD4 microRNA——microRNA-608（miR-608），在HepG2 细胞和人原代HCC 细胞中，使用慢病毒构建体过表达miR-608 诱导BRD4 下调，抑制细胞增殖；相反，miR-608 抑制剂的转染增加BRD4 表达，促进HepG2 细胞增殖，表明BRD4 是HepG2 细胞中miR-608 的主要靶基因［38］。
  此外，引入3' 非翻译区（3'-UTR）突变体BRD4（UTR-A1718G）可阻断miR-608诱导的HepG2细胞中的c-Myc 下调和增殖抑制。
  体内研究显示，在表达miR-608 或BRD4 CRSIPR/Cas9-KO 构建体中，HepG2异种移植瘤的生长被显著抑制，且BRD4mRNA 在人HCC 组织中上调，这与miR-608的下调有关。
  因此，研究者得出结论，miR-608可能通过靶向BET 家族蛋白BRD4来抑制HCC 细胞增殖。
  BRD4 作为转录辅助因子调控多种基因的表达，由于其广泛的细胞生物学功能，BRD4 还与多种肿瘤密切相关。
  MiguelF 等发现BRD4 在原发性和转移性黑色素瘤组织中表达明显上调［39］。
  BET 置换后，细胞周期的关键基因（SKP2，ERK1 和c-MYC）随着细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂（p21、p27）的积聚而下调，随后发生细胞周期停滞，且BET 抑制剂的效果不受BRAF 或NRAS 的影响。
  BET 抑制剂可抑制体外黑色素瘤细胞增殖和体内肿瘤的生长和转移，而通过沉默BRD4 基因，可得到同样的效果。
  对BET 抑制剂处理后的细胞进行RNA 测序，显示其对细胞生长、增殖、周期调节和分化具有显著影响。
  Tan 等发现，前列腺癌组织标本和细胞中，BRD4 表达明显增加，通过短发夹RNA 或JQ1 抑制BRD4 后，可降低前列腺癌细胞增殖、诱导G 0 /G 1 期停滞和凋亡、减少体外细胞的侵袭和迁移、抑制体内肿瘤生长［40］，因此BRD4 的异常表达可能会诱导前列腺癌变。
  BRD4 抑制剂诱导的细胞周期阻滞与p21 和细胞周期蛋白D1 的上调相关。
  c-Myc 和B 细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）是负责细胞周期调节和抗凋亡功能的重要基因，而BRD4 抑制剂可下调P21 与c-Myc。
  综上所述，BRD4 作为一种表观遗传调节因子和转录辅助因子，与基因转录、细胞周期和凋亡、侵袭和转移密切相关。
  BRD4 的表达异常会导致多种基因表达失调，从而影响相关基因的功能，并且与肺癌、乳腺癌、急性髓系淋巴瘤等多种肿瘤的发生发展密切相关。
  科学家针对BRD4 开发出了多种BRD4 抑制剂，均显现出良好的抗癌作用，但目前仅发现部分受BRD4 抑制剂调节的靶基因和信号通路，且在不同肿瘤中各不相同。
  因此，BRD4 及其抑制剂在各个肿瘤中的作用机制仍需多组学的全面深入研究。
  此外，目前问世的BRD4 抑制剂主要集中于单一结构域上，且结构改造较单一、增效有限。
  因此，研发抑制BRD4 双结构域的小分子化合物有望为BRD4 抑制剂在多种肿瘤中的应用带来新的曙光。