text: 推荐 | 小分子化合物结构确证经验总结
  单一组分化合物通常是定向合成、天然产物提取、发酵提取或半制备等方式制备得到，通过液相或气相等检测手段评估纯度（原料药纯度通常≥99.0%；杂质纯度通常≥90.0%）后，主要通过核磁共振氢谱（1H-NMR）、光谱及常规质谱（MS）等方法，基于合成机理推断平面结构；如合成机理不明确，采用提取方式获得，或氢谱及质谱等常规方法对化合物结构判断的信息作用不大，则需要投入更多确证方法来辅助结构判断，如借助碳谱（13C-NMR），二维核磁等来确证；在解析得到平面结构后，如判断存在立体构型，应采用针对立体结构相应的研究手段，如NOESY、圆二色谱（CD）、单晶衍射等进行确证。化合物结构初步确证后，按照相关指导原则，笔者根据化合物类别，对原料药（新化学实体、已知化合物）、起始物料/中间体/杂质（新化合物、已知化合物）结构确证的相关研究内容列表整理如下[1~3]。表1 不同类别化合物的结构确证方法判断下文是笔者对曾用到的结构确证相关技术进行的简单阐述，因结构解析是一门系统的学科，内容较多且精深，在此不做具体结构解析的陈述。3.1 高分辨质谱（HRMS）/质谱（MS）与常规质谱相比，高分辨质谱（HRMS）测得化合物的分子量可精确至小数点后第四位，常用于辅助确定化合物的分子质量和和分子式，前提是通过核磁共振波谱已初步确定化合物结构。某些情况下，质谱可以起到结构确证的关键作用。笔者曾解析一新化合物，在初步推断得到平面结构后，发现分子量与推断的结构不一致。仔细观察质谱发现，在分子离子峰右侧还有一M+2的离子峰（丰度比约3:1），才恍然醒悟分子结构中含有氯原子，新化合物结构得以破解。卤素常有同位素峰，分子结构中存在的氯（Cl）和溴（Br）较典型，当分子中含有1个氯或溴时，相对丰度比分别为3:1或1:1；含有多个氯或溴时，笔者一般是手动计算，或采用Chemdraw中的Analysis m/z值来判断。质谱解析中还有一条大家都比较熟悉的“氮规则”：化合物分子不含氮或含偶数个氮原子时，其分子离子的质量是偶数；化合物分子含奇数个氮原子时，其分子离子的质量是奇数。3.2 元素分析元素分析对化合物中的各元素进行含量测定，确定各元素的百分含量。针对各元素的特点，元素分析可选择的方法较为多样。碳、氢、氮元素检测通常采用燃烧分解法；含卤素或硫的化合物，采用氧瓶燃烧-滴定法（中国药典2020年版四部通则0703）；金属元素可采用电感耦合等离子发射光谱法（ICP-OES）；磷元素可采用酸分解-比色法等。测定完毕，比较测试结果与理论结果差值的大小，指导原则[1]规定“一般要求误差不超过0.3％”，在实际遇到的一些案例中，会存在样品容易吸潮或化合物含较多游离水，导致测试结果与理论结果误差超过0.3%。在元素分析解析时，建议元素百分含量测定值扣除化合物的水分测定结果后，再与理论值比较误差。3.3 一维核磁共振波谱取化合物2mg~10mg装入核磁管，用合适的氘代试剂进行溶解，用核磁共振波谱仪（频率通常400M~800M）进行检测，内标物为四甲基硅烷（TMS）。1H的天然丰度较13C高很多，核磁测试时，两者频率通常是4倍关系，如氢谱（1H NMR）600M频率对应碳谱（13C NMR）150M频率；碳谱的响应较氢谱低，如果化合物量较少，在测试碳谱时，可通过积累扫描时长增加碳谱的响应；分子量大的化合物较分子量小的化合物检测用量要多。氘代试剂的选择也非常关键，比较常见的氘代试剂有DMSO-d6，CDCl3，D2O，Methanol-d4，(CD3)2CO等。某些情况下，化合物的化学位移可能与氘代试剂（或氘代试剂中存在的水）在氢谱或碳谱中的化学位移重叠，影响结构确证，就需要更换氘代试剂进行测定。指导原则[1]规定“对含有活泼氢的药物必需进行氘代实验，以提供活泼氢的存在以及位置的信息。”，选择氘代试剂时，可采用重水交换来确认活泼氢的存在。同时，可结合二维1H-1H COSY谱进行确认。核磁出图后，研发人员常用MestRenova软件对图谱进行化学位移和积分处理，采用Chemdraw软件预测化合物的氢谱和碳谱数据，辅助判断平面结构。如果化合物为已知化合物，通过与文献报道的氢谱（1H NMR）或碳谱（13C NMR）数据进行比对，则较易解析。微谱数据库可进行检索查新，目前数据库中已收载137万多种化合物的碳谱数据，为植物化学或天然产物研发工作者提供了较大的便利。只需在微谱数据库中录入已获得的碳谱数据，则能很快获得文献已发表化合物和待解析化合物的相似度。该数据库需要收费[4]。除了氢谱（1H NMR）和碳谱（13C NMR），DEPT（无畸变极化转移增强技术）和APT（碳连氢谱）也是一维核磁波谱。DEPT和APT谱用得较少，它们的作用是判断碳的类型。普通13C-NMR出的化学位移棒均是“朝上（正）”，DEPT和APT谱出的化学位移棒“有上（正）有下（负）”，常用135°DEPT。在135°DEPT实验中所有的季碳都不出峰，伯、叔碳为正（棒朝上），仲碳为负（棒朝下）。APT谱中季碳可以出峰，信号强度较DEPT谱增加。3.4 二维核磁共振波谱二维核磁共振波谱是对平面结构进行确证的关键。常用的为：HMBC（检出1H异核多键相干技术）、HSQC（检出1H异核单量子相干技术）、COSY（同核位移相关谱）、NOESY（核极化效应相关谱）。HMBC对推断结构最为高效，它是看相隔2个或3个键氢原子与碳原子的远程相关性；COSY（通常是1H-1HCOSY）看相邻碳相连氢原子的相关性；HSQC看直接相连的碳氢相关性。通常通过这三种技术，即可初步确认化合物的平面结构。JNP（Journalof Natural Products）杂志近期发表的某新的萜类化合物1的平面结构推断见图1，红色箭头表示的是根据HMBC谱推断的碳氢相关性，蓝色粗线表示的是1H-1H COSY谱推断的氢氢相关性。该化合物平面结构确证后，其相对构型通过NOESY谱进行确定，NOESY谱上可反映空间上的氢氢相关性，见图2，黑色箭头标出了空间氢原子相关。详细的解析过程和核磁共振图谱数据可查询参考文献[5]。图1-新化合物1平面结构（红色箭头：HMBC；蓝色粗线：key COSY）图2-新化合物1空间NOE相关性（黑色箭头：NOESY）3.5 圆二色谱（CD）圆二色谱（CD）是用于推断非对称分子的构型和构象的一种旋光光谱，可用于确证化合物的绝对构型。上述新化合物1在通过二维核磁波谱确定了平面结构和相对构型后，通过圆二色谱计算结果与实验结果的拟合（见图3），最终确定了其绝对构型。图3-新化合物1的圆二色谱及立体构型3.6 单晶X-射线衍射（XRSD）单晶X-射线衍射（XRSD）也是确定绝对构型的常用方法，可测定晶态分子的晶胞参数、晶系、空间群，可提供一个化合物在晶态中所具有原子的精确空间位置。该技术主要涉及单晶培养和检测。晶体培养难度较大，需不断尝试且有足够耐心。剑桥晶体数据中心（CCDC, the Cambridge Crystallographic Data Centre）自1965年起就从事晶体数据的收集、整理与计算机化工作，该中心发展的剑桥结构数据库系统CSDS(CSDS，the Cambridge Structural Database System)是基于X光和中子衍射实验唯一的小分子及金属有机分子晶体的结构数据库（网址：https://www.ccdc.cam.ac.uk/structures/），其中收录了113万多化合物的晶体结构，每一个化合物均有自己的CCDC编号[6]。图4是新化合物2的热椭圆形点图（ORTEP图）和CCDC数据库收录（CCDC编号：2048214）的3D动态模拟图截图[5]。图4-新化合物2的ORTEP图及CCDC（编号：2048214）收录的3D动态模拟图截图3.7 其他结构确证技术除上述结构确证方法外，还有很多其他的结构确证技术，如红外、紫外、拉曼光谱、热重分析（TG）、差示扫描量热法（DSC）、旋光光谱等。红外光谱、热重分析（TG）、差示扫描量热法（DSC）、偏光显微镜法等对化合物晶型的判断也可起到辅助作用。某些化合物在固态时会表现出多晶型，多晶型会表现出红外光谱的差异；通常，结构中微小的差别会使红外光谱有很明显的差别[7]。老药组胺H2受体阻抗剂“西咪替丁”，参比制剂使用的原料药为A晶型，其原料药还存在另外三种晶型B、C、D，此外还有混合晶型。ABCD这四种晶型在红外光谱中的吸收存在微小差异（见下表），根据这些差异，可采用红外光谱来对A晶型产品进行鉴别[8]。此外，DSC也显示A晶型和B晶型在起始熔点和最高吸热峰存在差异，可用于晶型鉴别[9]。表2 西咪替丁ABCD四种不同晶型的红外吸收峰本文对小分子化合物的结构确证方法进行了初步汇总，实际工作中，因化合物结构和性质差异，对结构确证技术方法的选择和应用应仔细剖析后使用。星标亲爱的圈友们，不星标《注册圈》公众号，不仅会收不到我们的最新推文，还会看不到我们精心挑选的封面大图！星标《注册圈》，不错过每一篇精彩内容。希望我们像以前一样，日日相伴。编辑 \注册圈/来源\药品研发驿站△声明 | 文章版权归原作者所有，不经允许禁止转载！文章内容为个人观点，平台、编辑对文中陈述、观点判断保持中立，不对所包含内容的准确性、可靠性或完整性提供任何明示或暗示的保证，仅作参考；如涉及侵权或不实等，请务必联系小编删除！小编：JD31431155点击，上浏览更多精彩