text: 代谢学人——Nature：CLSTN3β--让脂滴成为“蜂巢”
  撰文 | 刘梓棋 郑宇含 张婷 王佳雯 李雨编辑 | 孟美瑶校对 | 张彦康脂肪组织中含有丰富的LD（脂滴），用于脂质的储存，而不同功能的脂肪组织其LD的形态也是有所不同的，其中白色脂肪组织中的LD呈单房大LD形态，而棕色脂肪组织则主要含有多房小LD。目前，多房小LD也被认为是产热脂肪组织的标志，目前有研究表明这些多房小LD的形成可通过提高LD表面积与体积的比例，促进脂肪分解产生FFA，FFA运输到LD附近的线粒体中进行β-氧化和线粒体产热。然而，产热脂肪细胞中多房小LD的形成机制目前仍不清楚。有研究表明LD融合主要由CIDE（诱导细胞死亡的DFFA样效应因子）蛋白调控。CIDE蛋白定位于LD表面，通过促进LD与LD接触，并促进脂质从一个LD向另一个LD中转移，从而使小LD转变为大LD。关于CIDE家族，主要有三个成员：CIDEA、CIDEB、CIDEC。CIDEs以细胞类型特异性方式发挥促LD融合功能。其中白色脂肪细胞中高表达CIDEC，棕米色脂肪细胞中富含CIDEA/C，肝细胞中主要含有CIDEB。在小鼠和人类脂肪组织中的研究表明，CIDEs的缺乏可促进脂肪细胞多房小LD的形成，从而缓解肥胖相关代谢紊乱现象（小编注：CIDEA的功能与其在细胞中的定位有关，CIDEA可定位于细胞质和细胞核。有研究表明，CIDEA在细胞质中，定位于LD表面，促进LD融合。然而，也有文献发现Cidea还具有转录活性功能，在诱导脂肪棕色化过程中，CIDEA蛋白水平显著上调，使CIDEA从LD穿梭到细胞核中，特异性抑制LXRα对Ucp1增强子活性的抑制作用，促进PPARγ与Ucp1增强子的结合，从而促进Ucp1的转录表达，因此脂肪细胞中CIDEA的高表达也可以表征产热水平）。然而，鉴于白色和棕米色脂肪细胞中CIDEs蛋白的高表达，但白色和棕米色脂肪细胞中又出现LD形态差异，因此，可能在棕米色脂肪细胞存在某种尚未确定的因子，特异性调控棕米色脂肪细胞中的CIDEs活性，从而影响了LDs的形态。LD是由中性脂质、甘油三酯和固醇酯组成，被磷脂单层膜所包围。既往研究发现LD的生物合成发生在ER（内质网）中，被广泛接受的模型是：在ER驻留酶Dga1和Lro1（二酰甘油酰基转移酶，催化二酰甘油与脂肪酸合成甘油三酯，是甘油三酯合成途径的限速酶）的催化下形成甘油三酯，并在内质网的双分子层中积累，形成晶状体，晶状体在细胞质中生长发芽，生成一个新的成熟的LD。新生的LD可附着在内质网膜上，也可与内质网膜分离。在2019年Nature上发表的一项研究发现，产热脂肪细胞中特异性表达一种CLSTN3β蛋白，定位于内质网膜，通过促进S100b（棕色脂肪细胞分泌生长因子）蛋白的表达和分泌，促进棕米色脂肪细胞的交感神经支配，从而增强棕米色脂肪的产热水平。然而，定位于内质网膜的CLSTN3β蛋白是否参与调控LD形态，目前尚不清楚。于2022年12月7日发表在Nature上的文章，发现CLSTN3β是产热脂肪细胞中多房小LD形成的关键蛋白。CLSTN3β定位于ER-LD连接位点，通过与LD表面CIDEs结合，抑制CIDEs功能，进而抑制LD融合。而CLSTN3β的缺失可导致BAT组织形成单房大LD，并进一步损害BAT的产热功能。总之，这一发现为产热脂肪中多房小LD的发生机制提供了理论基础。1. CLSTN3β蛋白通过N端保守的疏水发夹结构域定位于ER-LD连接位点；2. CLSTN3β缺失导致BAT组织LD呈单房态，并损害产热功能，而过表达CLSTN3β可促进BAT组织LD呈多房态，并促进脂质利用；3. CLSTN3β通过抑制CIDEs功能来抑制LD融合；4. CLSTN3β可表征人类脂肪组织的多房小LD。前期有研究表明CLSTN3β是Clstn3基因在产热脂肪细胞中特异性表达产物，定位于内质网膜。为了确定CLSTN3β是否与LD的形成有关，研究人员经RNA-seq分析发现在棕色脂肪细胞分化过程中Clstn3基因表达水平显著上调（辅图1a）；随后研究人员对棕色脂肪细胞中Clstn3基因RNA序列进行可视化分析发现了Clstn3的一个新转录本，它包含有一段先前未被注释的外显子序列，并与已知的Clstn3亚型的外显子17与18相连接，研究人员将含有这段未知外显子序列的新转录本定义为Clstn3b（小编注：本文作者发现了一段新的外显子，这段外显子位于已知的Clstn3亚型的内含子16上，与外显子17和18相连接，将这段含有新外显子的Clstn3亚型定义为Clstn3β）。进一步ATAC（染色质可及性分析）、CAGE（基因表达的加帽分析）以及H3K4me3-ChIP分析发现Clstn3b的表达主要由内含子16中的选择性启动子所驱动（辅图1a）（小编注：全长的CLSTN3仅在大脑中表达，是一种突触组织蛋白，促进神经元中兴奋性和抑制性突触前分化，在神经发育中发挥着重要作用）。随后作者详细分析了BAT中Clstn3b的转录本（辅图1b）。研究人员对大脑皮层和BAT进行了全基因组差异可变剪接分析，鉴定出了1284种差异内含子剪接事件，发现Clstn3的第16个内含子发生差异剪切并在总的事件中排名第八（辅图1c），其在大脑皮层中该内含子被100%保留在Clstn3转录本中，而在BAT中存在三种不同的剪接方式，产生三种不同的Clstn3b转录本变体（辅图1d），经5’RLM-RACE和RT-PCR验证，表明BAT中确实存在三种不同的Clstn3b转录本变体（辅图1e-f）。随后，研究人员使用靶向CLSTN3蛋白C端抗体分析棕色脂肪细胞中CLSTN3β蛋白表达，结果显示在整个细胞裂解液中，存在一条分子量约25kDa条带，然而分离细胞膜，提取并检测膜蛋白，可以发现除了分子量25kDa条带外，还存在一条分子量约为40kDa的条带（辅图2a），这两个条带均是由Clstn3b转录本（变体2）编码（辅图2b），但40kDa条带是由Clstn3b最长ORF（开放阅读框）所编码，而25kDa条带是由Clstn3b最短ORF所编码（辅图2c-d）。进一步研究发现Clstn3仅在大脑中表达，而Clstn3b主要是在BAT中富集表达，在肝脏和WAT（白色脂肪组织）中表达水平较低（辅图2g）。但研究人员发现在BAT和WAT中，Clstn3b表达水平随环境温度的降低而上调，这一现象与β3-肾上腺素能受体激动剂的刺激效应类似（辅图2h-i），且脂肪细胞分化、短期HFD喂养以及PPARγ激动剂刺激也可显著促进Clstn3b表达（辅图2j-l）。ChIP实验证明PPARγ与Clstn3b启动子结合，这与已发表的ChIP-seq数据结果一致（辅图2m-n）。总之，这些结果表明Clstn3b基因表达受寒冷和PPARγ调控。研究人员进一步在棕色脂肪前体细胞中过表达CLSTN3β-APEX2 C端融合蛋白（小编注：APEX2是增强抗坏血酸过氧化物酶，类似于FLAG，是一种小分子标签），电镜观察发现CLSTN3β蛋白定位于ER（内质网），其C端区域朝向ER腔（图1a）。然而，利用OA（油酸）处理棕色脂肪前体细胞或诱导其分化产生LD后，CLSTN3β仅定位于ER-LD连接位点（图1a和辅图3a）。且在3T3-L1细胞和Hela细胞中也观察到CLSTN3β定位于ER-LD连接位点（图1b-c）。使用OA处理HEK293T细胞后，提取HEK293T细胞外周膜蛋白，发现CLSTN3β并不存在于外周膜蛋白中；且CLSTN3β蛋白位于ER腔的C端可免受胰蛋白酶的消化（辅图3b-c），表明CLSTN3β重新定位于LD上后仍是一个整合膜蛋白。此外，棕色脂肪细胞内源性CLSTN3β蛋白也定位于ER-LD接触位点（图1d）。接下来，为了探究介导CLSTN3β定位于LD的结构域，研究人员探究了一系列CLSTN3β蛋白截断突变体的定位，发现CLSTN3β蛋白N端特异性结构域对其定位于LD是必需的（图1e-f），这表明靶向LD是CLSTN3β蛋白亚型的一个独特功能（小编注：本文发现CLSTN3β的N端是该蛋白的特异性结构域。具体而言，研究人员构建了不同的蛋白截断突变体，即全长的CLSTN3β蛋白、CLSTN3β N端的特异性结构域、CLSTN3β与CLSTN3共享的结构域，经免疫荧光染色发现只有全长CLSTN3β和N端特异性结构域可以与LD共定位，说明CLSTN3β N端的特异性结构域是CLSTN3β定位于LD的关键结构域），由于CLSTN3β与其他蛋白缺乏同源性，其N端特异性结构域并不包含已知的功能结构域。利用TMHMM预测发现三个跨膜螺旋结构域，然而这三个跨膜螺旋结构域并不具有两亲特性，不能与LD结合（辅图3d-e）。通过蛋白二级结构预测和RoseTTAFold蛋白结构预测分析发现这三个跨膜螺旋结构可能是一组三个疏水发夹结构的一部分（辅图3f），此外研究人员还预测到CLSTN3β特异结构域可能含有带正电荷的两亲β链（辅图3e），这些结构可能介导CLSTN3β与LD的结合。随后研究人员经实验验证发现，删除CLSTN3β蛋白的发夹结构（ΔH123）可抑制CLSTN3β定位于LD，而删除β链（Δβ）并不影响CLSTN3β的定位（图1g），这表明疏水发夹结构是介导CLSTN3β定位于LD的关键结构域（小编注：研究人员利用TMHMM预测出CLSTN3β N端为3个跨膜螺旋结构，而单独分析这3个跨膜螺旋结构，其本身不具有可以与LD结合的两亲性。随后研究人员通过蛋白二级结构预测RoseTTAFold蛋白结构预测分析发现这3个跨膜螺旋结构组合形成了一组疏水发夹结构，该疏水发夹结构可能介导了CLSTN3β与LD的结合）。且当只删除一个或两个发夹结构时CLSTN3β仍可定位于LD，尽管CLSTN3β定位于LD的效率会有所降低（辅图3g-h）。总之，这些结果表明CLSTN3β通过其N端疏水发夹结构结合LD，从而使CLSTN3β定位于ER-LD接触位点，而其C端跨膜结构域（CLSTN3蛋白也含有）仍锚定在ER上（图1h）。为了探究诱导CLSTN3β定位于ER-LD连接位点的机制，研究人员在棕色脂肪细胞中过表达CLSTN3β-APEX2-Flag，通过（1）APEX2临近标记或（2）Flag免疫沉淀两种途径分离CLSTN3β相互作用蛋白，进行蛋白互作组学分析，得到287个可能与CLSTN3β蛋白相互作用的潜在蛋白（辅图4a）。GO分析显示这些与CLSTN3β蛋白相互作用的潜在蛋白主要富集于ERAD途径（ER相关的蛋白降解途径）（辅图4b）。先前研究表明富集在LD上的含发夹结构膜蛋白由于其在ER双分子层中的蛋白构象不稳定，导致其经ERAD途径降解。因此，研究人员利用CB-5083（可抑制ERAD底物的降解）处理棕色脂肪细胞，发现CB-5083显著抑制了内源性CLSTN3β的降解，表明ERAD途径介导了CLSTN3β蛋白的降解（辅图4c）。同样，在Hela细胞中，CLSTN3β仅定位于小点状结构位置，该小点状结构可能代表Hela细胞中LD生物发生的位点，然而利用CB-5083处理Hela细胞后，CLSTN3β弥漫性分布在ER中，并不与LD结合（辅图4d）。在HEK293T细胞中共转染CLSTN3β-Flag和HA-泛素蛋白后进行免疫沉淀实验，发现CLSTN3β被泛素化修饰，且MG132或CB-5083处理后显著抑制了泛素化CLSTN3β的降解（辅图4e）。在CLSTN3β蛋白互作组学分析中，排名靠前的潜在蛋白为AMFR（E3连接酶自分泌运动因子受体）/gp78和UBE2G2（AMFR同源E2结合酶）。研究人员发现gp78和UBE2G2蛋白水平与HEK293T细胞中CLSTN3β蛋白水平相关，过表达gp78可显著促进CLSTN3β蛋白泛素化，降低CLSTN3β蛋白水平，而敲减gp78则促进了CLSTN3β蛋白稳定性（辅图4f-g）。总之，这些结果表明CLSTN3β主要富集在ER-LD连接位点，部分是由于定位于ER的CLSTN3β蛋白通过UBE2G2-gp78 ERAD途径被降解（小编注：之前有项研究认为LD蛋白的疏水发夹结构在磷脂双分子层膜中可能表现出一些构象不稳定或错误折叠蛋白的特征，从而被ERAD途径识别并降解；而LD是由磷脂单分子层膜所包围，当蛋白定位于LD表面，其疏水发夹可能采用更有利的构象，从而逃脱被ERAD途径降解的命运。参考文献：Annamaria Ruggiano, et al. EMBO J. 2016 Aug 1;35(15):1644-55. ）。4.敲除CLSTN3β可干扰LD的形态和功能为了探究CLSTN3β蛋白的生理功能，研究人员构建了全身敲除CLSTN3β小鼠（CLSTN3β KO小鼠）和脂肪特异性敲除CLSTN3β小鼠（AdC3KO小鼠）（辅图5a-d），在标准条件下（22℃）给小鼠饲喂正常饮食，发现虽然AdC3KO小鼠的体重和体脂与WT小鼠相似，但AdC3KO小鼠BAT组织看起来比WT小鼠BAT的体积更大、颜色更浅（图2a和辅图5e）。且与WT小鼠相比，AdC3KO小鼠和CLSTN3β KO小鼠BAT中TG水平更高（图2b）。HE染色结果显示AdC3KO小鼠BAT组织明显发生白色化（图2c-d）。随后，研究人员将AdC3KO小鼠置于4℃下冷刺激4天，发现虽然AdC3KO小鼠BAT组织TG水平和LD面积显著高于WT小鼠，但在4天的冷刺激期间AdC3KO小鼠仍可维持其核心体温（辅图5f-i）。然而将小鼠预先置于热中性环境中，以排除小鼠脂肪产热以外的其他器官的补偿产热机制，随后对小鼠进行急性冷刺激，发现与WT小鼠相比，AdC3KO小鼠和CLSTN3β KO小鼠的核心体温显著降低（图2e）。随后研究人员对急性冷刺激前后AdC3KO小鼠BAT组织进行RNA-seq分析，发现受寒冷调控的基因表达程序并没有发生显著变化（图2f）。且在寒冷刺激或罗格列酮刺激下，虽然与WT相比，CLSTN3β的缺失显著抑制了小鼠BAT和iWAT组织的棕色化现象，但BAT和iWAT（腹股沟白色脂肪组织）组织的经典产热基因表达并没有发生显著变化（辅图5j-l）。总之，这些结果表明脂肪组织CLSTN3β的缺失可抑制小鼠的产热能力，而这种产热能力的损失与产热基因的表达水平无关。由于CLSTN3β特异性定位于ER-LD连接位点，因此研究人员推测在产热脂肪组织中CLSTN3β可能发挥调控脂质利用的功能。与这一假设一致的是，AdC3KO小鼠和CLSTN3β KO小鼠RER显著高于WT鼠（图2g），表明AdC3KO小鼠和CLSTN3β小鼠更偏向于利用碳水化合物作为能量底物。为了直接评估AdC3KO小鼠和CLSTN3β小鼠BAT中碳水化合物的利用率，研究人员利用PET-CT检测急性寒冷刺激期间BAT摄取18F-FDG（18F-氟脱氧葡萄糖）的能力，结果显示AdC3KO小鼠BAT中18F-FDG水平显著高于WT小鼠（图2h-i）。接下来，为了评估AdC3KO小鼠BAT组织的脂质利用水平，研究人员分离WT小鼠和AdC3KO小鼠BAT组织LDs，发现AdC3KO小鼠LDs上脂解相关蛋白表达水平显著低于WT小鼠（辅图6a-b）。而AdC3KO小鼠iWAT组织的脂解水平与WT小鼠无明显差异，可能是由于CLSTN3β在WAT中表达水平较低（辅图6c）。在HFD喂养下，研究人员发现AdC3KO小鼠和CLSTN3β KO小鼠BAT组织重量显著高于WT小鼠，但体重和体脂水平与WT小鼠相似，且整体能量消耗水平与WT小鼠相比并无明显差异（辅图7a-e）。总之，这些结果表明脂肪组织CLSTN3β的缺失抑制了机体对脂质的利用，从而代偿性利用碳水化合物作为能量来源，导致BAT脂质沉积，但这一现象并不会影响整体能量代谢平衡。最近有研究发现CLSTN3β可促进产热脂肪组织的交感神经支配。因此研究人员通过对AdC3KO小鼠和CLSTN3β小鼠BAT组织的交感神经纤维进行三维成像分析（辅图8a-d），以及检测BAT和iWAT组织中络氨酸羟化酶蛋白水平（辅图8e-h），以评估脂肪组织CLSTN3β对交感神经支配的调控，结果发现CLSTN3β的缺失并不影响BAT和iWAT的交感神经支配。此外，脂肪组织CLSTN3β的缺失也不影响BAT和iWAT的交感神经支配下游蛋白的变化，包括cAMP依赖性蛋白激酶底物的磷酸化修饰水平和UCP1蛋白的表达水平（辅图8e-h）。总之，这些结果表明脂肪组织CLSTN3β的缺失并不影响交感神经支配和β-肾上腺素能信号。为了进一步探究脂肪组织CLSTN3β的生理功能，研究人员构建了CLSTN3β KO棕色前体脂肪细胞系，并在该细胞系中过表达mCherry或CLSTN3β-mCherry（辅图9a）。表型上，研究人员发现与过表达mCherry的CLSTN3β KO棕色脂肪细胞相比，在CLSTN3β KO棕色脂肪细胞中过表达CLSTN3β-mCherry显著增加了LD的数量，并减小了LD的大小，产生“葡萄簇状”多房小LDs。且这一现象在原代棕色脂肪细胞中也可观察到（图3a-c和辅图9b）。功能上，研究人员发现过表达CLSTN3β-mCherry可促进棕色脂肪细胞的耗氧率，这是由于CLSTN3β的过表达促进了棕色脂肪细胞的脂解和脂肪酸氧化水平，而线粒体含量并无明显变化（图3d和辅图9c-d）。与这一结果相一致的是，研究人员从脂肪细胞中分离LD，发现过表达CLSTN3β的脂肪细胞LD中脂解相关蛋白ATGL和CGI58表达水平显著升高（图3e-f和辅图9e）。总之，这些结果表明，脂肪细胞CLSTN3以细胞自主的方式促进脂肪细胞多房小LDs的形成，并促进脂质利用。为了研究体内过表达CLSTN3β是否也可以诱导脂肪组织多房小LDs表型，研究人员对AdC3KO小鼠尾静脉注射AAV8-FLEX-GFP/CLSTN3β，使AdC3KO小鼠脂肪细胞中表达GFP或CLSTN3β（小编注：FLEX可调控目的基因的组织特异性表达。在AAV8-FLEX载体中，Clstn3b基因两侧分别连接两个LoxP位点，当Cre重组酶不存在时，Clstn3b基因不表达，当Cre重组酶存在时便可诱导Clstn3b基因的表达。在本研究中，研究人员对AdC3KO小鼠尾静脉注射AAV8-FLEX-CLSTN3β，由于AdC3KO小鼠的脂肪组织中存在Cre重组酶活性，因此可以实现CLSTN3β在脂肪组织的特异性表达）。随后研究人员将小鼠置于4℃冷刺激4天，使脂肪细胞LD的初始大小最小化，再置于30℃刺激11天，观察在肾上腺素能作用最小的条件下，CLSTN3β对LD表型的调控作用（小编注：研究人员将小鼠置于4℃环境冷刺激，是为了将脂肪细胞LD初始大小最小化，随后放在热中性环境中，促进LD的扩张，以探究在肾上腺素能作用最小的条件下，CLSTN3β对LD表型的调控作用，结果显示与表达GFP的脂肪组织相比，过表达CLSTN3β的脂肪组织仍可维持多房小LD形态。由于cold诱导多房小LD形态的因素比较多，而在热中性条件下观察，排除了诱导脂肪产热相关的因素（如肾上腺素的作用），可以更好地证明CLSTN3β对LD形态的调控作用），发现与表达GFP的小鼠相比，过表达CLSTN3β显著促进了小鼠BAT组织多房小LDs的形成，但不影响产热相关基因表达水平和酪氨酸羟化酶蛋白水平（图4a-e和辅图9f）。接下来，为了探究CLSTN3β是否也可以调控WAT组织的LD形态，研究人员对AdC3KO小鼠的asWAT（皮下脂肪组织）局部注射AAV8-FLEX，并将小鼠置于4℃下冷刺激8天，再置于30℃下刺激12天，发现与表达GFP的小鼠相比，过表达CLSTN3β显著促进了小鼠asWAT组织多房小LDs的形成（图4f和辅图9g）。总之，这些结果表明CLSTN3β可促进BAT和WAT组织形成多房小LDs。6.CLSTN3β表征人类脂肪细胞的多房小LDs为了探究Clstn3b基因的进化保守性，研究人员对与鼠源Clstn3b特异性ORF相似的核苷酸序列进行BLAST搜索，发现Clstn3b基因的进化保守性仅限于胎盘哺乳动物（辅图10a）。最早具有Clstn3b同源基因的生物之一是小马岛猬（Echinops telfairi），据报道它是一种古老的恒温真兽类哺乳动物。虽然在非哺乳类脊椎动物中也发现了Clstn3基因，但在进化过程中Clstn3b基因出现得较晚，与脂肪产热作为一种体温稳态机制这一观点的发现相一致。研究人员对人类大脑皮层和脂肪组织中Clstn3基因进行RNA测序，结果显示人类Clstn3基因外显子表达模式与小鼠相似（辅图10b）。先前研究表明Clstn3是人类单房和多房脂肪组织中表达最丰富的基因。为了验证这一结果，研究人员检测了健康人和嗜铬细胞瘤患者肾上腺周脂肪组织中Clstn3基因的表达水平，结果显示与健康人相比，嗜铬细胞瘤患者肾上腺周多房脂肪组织中Clstn3基因表达水平显著升高，且qPCR结果显示Clstn3外显子17/18和Clstn3b基因表达水平在多房脂肪组织中特异性上调（辅图10c-d）。随后研究人员设计了一个可靶向结合Clstn3b特异性ORF的RNAscope探针，该探针可在人类脂肪组织中与Clstn3b基因进行RNA原位杂交。研究人员利用RNAscope探针检测到在嗜铬细胞瘤患者的多房脂肪组织中高表达Clstn3b基因，而健康人或嗜铬细胞瘤患者的肾周单房脂肪组织中几乎不表达Clstn3b基因，在人类肾周多房脂肪组织切片中（小编注：这里使用了肾周脂肪组织。肾周脂肪包围着肾脏和肾上腺，肾上腺分泌肾上腺素和去甲肾上腺素（NE）以响应交感神经的激活，研究发现肾周多房脂肪细胞主要聚集在肾上腺附近，而肾周单房脂肪细胞聚集在远离肾上腺的区域），Clstn3b阳性染色也仅出现在具有多房小LDs形态的脂肪细胞的细胞核附近（图4g和辅图10e）。最后，研究人员构建了一个来自嗜铬细胞瘤患者的多房脂肪细胞cDNA文库，并克隆出了人类CLSTN3β（辅图10f），发现与小鼠相似的的是，人类CLSTN3β主要定位于脂肪细胞LDs处（辅图10g-h）。在对CLSTN3β的蛋白互作组学分析中，发现与CLSTN3β相互作用的潜在蛋白主要定位于LD或ER上（图5a），其中在8个LD蛋白中，研究人员发现CLSTN3β功能获得表型与CIDE功能缺失表型相似，具体而言，有研究表明CIDEs蛋白C端突变可促进脂肪细胞产生多房小LDs，因此，研究人员关注到了CIDEC蛋白（图5a）。Co-IP实验显示CLSTN3β可与CIDEA和CIDEC相互作用，但并不与RAB18（调控ER-LD连接位点的形成并促进LD的生长和成熟）或CGI58（小编注：CGI58定位于LD表面，是ATGL的辅激活因子，可与ATGL相互作用，促进脂解作用）相结合（图5b和辅图11a-c）。CIDEs蛋白C端包含可靶向结合LD的两亲螺旋结构以及调控LD融合的关键亚基，Co-IP实验进一步发现CLSTN3β与CIDEs蛋白C端区域特异性结合（图5c和辅图11d）。此外，在共表达CLSTN3β和CIDEA的Hela细胞和3T3-L1细胞中，CIDEA仍定位于LD（图5d和辅图11e），表明CLSTN3β与CIDEA的相互作用并不会影响CIDE与LD的结合。接下来，研究人员利用FRAP技术（光漂白荧光恢复技术，其原理是：用荧光物质标记细胞膜蛋白或膜脂质，借助于高强度脉冲激光来照射细胞某一区域，造成该区域荧光分子的光淬灭。如果膜蛋白是流动的，当停止激光照射后，漂白部位的荧光又可恢复，根据其恢复速度可以量化含有荧光标记探针的分子薄膜的二维横向扩散速率。）检测CLSTN3β对CIDE介导的脂质交换率的影响，发现过表达CLSTN3β显著抑制了漂白LD中CIDEA和CIDEC依赖的荧光恢复（图5e-g和辅图11f-h），表明CLSTN3β与CIDE结合可抑制CIDE介导的脂质转移。与这一结果相一致的是，在表达CIDEs的Hela细胞和棕色脂肪细胞中，过表达CLSTN3β可促进细胞产生多房小LDs（图5h和辅图12a-b）。此外，研究人员还发现在缺乏CLSTN3β的BAT组织中，CIDEA蛋白表达水平也显著下降（图5i和辅图12c），这可能是由于CIDE介导的脂质转移活性显著增加导致LD表面积减小，从而降低了LD上CIDE蛋白水平。但CLSTN3β并不影响CIDEs蛋白N端区域的相分离功能（辅图12d-f）。总之，这些结果表明CLSTN3β可与CIDEs相互作用，抑制CIDEs介导的脂质转移作用，并促进脂肪细胞中多房小LDs的形成。本篇文章发现CLSTN3β定位于ER-LD连接位点，通过抑制CIDEs介导的LD融合作用，促进脂肪细胞中多房小LDs的形成。缺乏CLSTN3β的小鼠脂肪组织LD形态呈单房大LD形态，并抑制BAT组织脂质的利用，进一步损害BAT组织的产热能力，但并不影响脂肪组织交感神经支配和β-肾上腺素能信号。相反，过表达CLSTN3β可促进脂肪细胞形成多房小LDs表型。机制上，研究人员发现CLSTN3β通过与定位于LD的CIDEs蛋白相互作用，抑制CIDEs的脂质转移功能，从而抑制LD融合，促进LD形成多房态。此外，研究人员还发现CLSTN3β也可表征人类脂肪组织的多房小LDs表型。总之，本篇文章发现了CLSTN3β通过调节LD表型和功能，以促进产热脂肪细胞的脂质利用的分子机制。原文链接： https://www.nature.com/articles/s41586-022-05507-1