text: 在多种人类疾病的发生、进展中，基因组的变异序列起着重要作用。全基因组关联研究及测序的成本不断下降，推动遗传疾病变异的鉴定。尽管检测到的遗传变异数量有所增加，但仍难以准确确定其对疾病进展的影响。为了更深入地了解遗传变异背后的分子机制并开发新的治疗策略，同基因的人类疾病模型具有很大应用前景。CRISPR作为基因工程的多功能工具，极大地推动了人类疾病等基因体外模型的产生。
  经典的2D组织培养易于维护，适合CRISPR-Cas9介导的基因工程，被广泛用于了解人体稳态和病理生理学，但不能反映来源器官的细胞复杂性，且通常来自恶性肿瘤。
  为了克服这些问题，类器官顺应而生，这些“微型器官”表现出真实的微观解剖结构，可产生天然组织中存在的细胞类型。目前的类器官培养技术利用诱导多能干细胞（iPSCs）或成体干细胞（ASCs）。来自iPSCs的类器官模拟感兴趣器官的胚胎发育轨迹，ASCs衍生类器官则可以模拟成体器官稳态，具备遗传稳定、可无限传代等特点。此外，ASCs类器官可由单个成体干细胞克隆扩增，有助于产生CRISPR介导的与起源组织非常相似的同基因3D培养物。除了变异影响鉴定外，这些同基因类器官模型还可用于药物功效筛选和从头药物发现。
  近日，类器官研究领域的领航者之一——Hans Clevers团队在《Nature Reviews Bioengineering》上发表题为“CRISPR engineering in organoids for gene repair and disease modelling” 的综述文章。
  阐述了在人ASCs衍生类器官中生成同基因疾病模型的基本原理。研究人员回顾了CRISPR介导的基因组工程的最新进展，及其在构建同基因疾病模型中人类ASCs衍生类器官里的应用。此外，研究人员还对CRISPR-Cas9介导的基因工程和ASCs衍生类器官之间的联合研究进行了展望。
  Hans Clevers
  CRISPR-Cas介导的基因工程
  CRISPR优于之前用于改变基因组的方法，已迅速被世界各地实验室采用，其中II类CRISPR系统（包括Cas9）研究最多。在传统CRISPR-Cas9介导的基因工程中，效应蛋白Cas9被向导RNA（guide RNA）引导至基因组靶位点，该向导RNA由CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRISPR RNA（tracRNA）组成。创建crRNA-tracRNA嵌合体可简化向导RNA，产生用于靶标识别的单向导RNA（sgRNA）。
  基因组中的靶位点由原间隔体和原间隔邻接基序（PAM）组成，最常用Cas9（SpCas9）的PAM基序是NGG。当sgRNA识别靶标后，Cas9-sgRNA复合物筛选并找到基因组中合适的PAMs，通过将R-loop中靶位点周围的DNA打开成两条单DNA链（ssDNA）来测试sgRNA与原间隔体的互补性。这些ssDNA链被Cas9的RuvC和HNH结构域单独切割，导致双链DNA断裂（DSB）。
  细胞会识别这种DSB，通过两个主要途径来修复损伤。在大多数情况下，会启动非同源末端连接（NHEJ），即两个DNA末端迅速连接在一起，但这通常会导致切割位点的小缺失或插入（indel）。CRISPR-Cas9诱导的indel，如果超出范围，会导致靶蛋白的早期终止。第二种途径是通过与外源性DNA修复模板的补充反应来启动同源性导向修复（HDR），该模板包含与DSB相邻DNA的同源性和目的编辑。因此，通过劫持内源性DNA修复途径，CRISPR能以sgRNA介导的方式用于基因工程。
  使用传统的CRISPR-Cas9构建同基因疾病模型存在关键缺点。首先，由于人类基因组由30亿个碱基对组成，因此sgRNA在脱靶位点启动DSB的可能性很大。其次，即便使用脱靶游离sgRNA，靶向DSB修复也可能导致不希望的编辑结果，例如诱导大量缺失、插入和易位。在极端情况下，CRISPR-Cas9可能导致染色体分裂。此外，DSB诱导时的HDR是模拟特定遗传变异所必需的，但HDR只能在细胞周期的G2、S期发生，当姐妹染色单体存在时，会偏向NHEJ修复途径。只有约2.4%的致病变异是indels，因此应寻找无需DSB诱导的基因工程替代策略。
  无DSB的基因编辑
  将SpCas9的HNH结构域中单个组氨酸残基及RuvC结构域中天冬氨酸突变为丙氨酸（D10A和H840A），会导致核酸酶无活性或“死”Cas9（dCas9）。dCas9仍然识别其靶位点并在R-loop中打开DNA，但不诱导DSB。dCas9与其靶位点的结合可以单独作为转录的抑制因子，被称为CRISPR干扰（CRISPRi）。dCas9还可用作将DNA效应蛋白定位到基因组的载体。
  1. 碱基编辑（Base editing）
  第一个碱基编辑器（base editor，BE）将dCas9融合到大鼠胞苷脱氨酶载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽样（rAPOBEC1）中，催化从胞苷到尿嘧啶的转化。细胞将该尿嘧啶修复为胸苷，产生一种构建体（BE1），该构建体用T•A碱基对取代C•G，称为胞嘧啶碱基编辑器（CBE）。
  第一代CBE被尿嘧啶糖基化抑制，通过将尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）融合到dCas9-rAPOBEC1融合中开发了第二代碱基编辑器（BE2）。为了提高编辑效率，dCas9可以转化为切口酶SpCas9-D10A。在这种优化的碱基编辑器架构（BE3）中，编辑效率在15%至75%之间，具体取决于sgRNA。进一步改进BE3架构可产生第四代胞嘧啶碱基编辑器（BE4），提高了编辑效率（约50%），意外副产物（如indels和点突变）减少了两倍。
  随后的密码子优化等产生了CBE架构，目前其可通过改善蛋白质的表达和核定位，在2D细胞系、类器官和体内实现最强大的碱基编辑。通过在称为Target-AID的系统中将胞苷脱氨酶1（CDA1）融合到SpCas9D10A，开发了类似的碱基编辑器，可实现C到T碱基的变化。此外，在Target-Aid中经常观察到C到G和C到A的变化，这些不需要的副产物在BE4等较新的CBE迭代中已经得到解决。
  然而，碱基编辑器有局限性。尽管BE基本上产生零脱靶效应，但由于APOBEC在细胞中的过表达，CBE显示出全基因组C>T突变。此外，CBE诱导的尿嘧啶残基有时会产生腺嘌呤和鸟嘌呤残基，而不是所需的胸苷。此外，目前并非所有所需的点突变都可以由碱基编辑器生成。碱基编辑器不能引入indels或更大的遗传变异，先导编辑器的开发克服这些限制，并允许更通用的无DSB基因工程。
  2. 先导编辑（Prime editing）
  在第一代先导编辑器（PE1）中，源自莫洛尼鼠白血病病毒的逆转录（RT）结构域与切口酶SpCas9-H840A融合。RT结构域将RNA转化为DNA，并在专门设计的sgRNA的3'延伸中找到其模板，称为初代编辑向导RNA（pegRNA），将PE1中的Cas9引导到靶位点。在目标识别后，含PAM的链被Cas9-H840A的活性HNH结构域切口。随后，pegRNA延伸与引物结合位点（PBS）处的切口链结合，PE1的RT结构域使用剩余的pegRNA（RT模板）合成包含目标编辑的3′-DNA flap结构。这种DNA flap通过整合目标编辑的细胞DNA修复过程来解决。
  通过使用RT结构域的合理进化变体（PE2），并在第二个（PE3）向导RNA的引导下诱导相反DNA链中的近端第二切口，可进一步提高先导编辑效率。但在先导编辑中使用PE3向导有一定成本，因为与PE2相比，indels数量要高得多。为了有效利用先导编辑，需要对pegRNA和PE3进行广泛优化。PBS和RT的长度，以及pegRNA和PE3向导缺口之间的距离会影响先导编辑的编辑效率。优化可在HEK293T细胞系中轻松进行，但在类器官或体内中更困难。但一旦完全优化，先导编辑会是迄今为止最通用的无DSB基因工程技术。
  先导编辑因潜在多功能性而具有很大应用前景，但优化pegRNA和PE3向导的需求限制了其在类器官中的应用。为了克服这个问题，研究人员对先导编辑系统进行了三项关键修改。首先，在具有重叠RT结构域的反式中使用两个pegRNA可提高人类细胞和植物的初代编辑效率。其次，工程化的pegRNA可以具有融合到3'端的evopreq或tmpknot结构域。这些结构域增加了pegRNA的稳定性，从而提高了先导编辑效率。最后，包括R221K和N394K氨基酸的变化增加了SpCas9的核酸酶功能，从而产生了更高效的PE2Max。
  同基因类器官疾病模型
  由于与2D细胞系相比，ASC衍生的类器官更接近其起源组织，因此它们更适合人体生理学研究。CRISPR介导的基因工程的快速发展，使得快速生成同基因类器官模型成为可能，这些模型包含在人类疾病的发作和过程中起作用的特定突变。
  1. 肿瘤发生和癌症
  大多数CRISPR生成的同基因ASC衍生类器官模型目前都集中在肿瘤发生。多重基因工程被应用于ASC衍生的类器官中，随后移植到小鼠体内，以阐明其他组织中肿瘤发生的最低要求。已有适用于研究胰腺导管腺癌（PDAC）的人源ASC导管胰腺同基因类器官模型，还有研究创建了CRISPR-Cas9介导的DNA修复基因敲除模型。此外在更复杂的方法中，将常见的融合基因DLG1-BRAF、PTPRK-RSPO3 和EIF3E-RSPO2建模为人类结肠类器官。CRISPR-Cas9策略同样可用于创建人肝细胞类器官中TP53的单突变或双突变同基因敲除模型等。
  在单个实验中也可对多基因进行CRISPR筛选。为了提高CRISPR的通量，已经开发了全基因组CRISPR筛选平台，允许在评估基因组中所有基因的功能丧失突变的同时进行阳性和阴性生存能力筛选。此外，已经开发了用于ASC衍生类器官的全基因组CRISPR筛选方案。这些研究强调了在3D模型中进行全基因组CRISPR筛选的可能性。
  为了准确模拟在癌症患者中观察到的突变，简单CRISPR-Cas9介导的indels形成的敲除还不足够。如TP53和KRAS 所示，同一癌症基因中的不同突变可能产生截然不同的效果，这突出了对特定突变的需求。对此，基于CRISPR的癌症建模先导编辑可以通过在人结肠和肝细胞类器官中引入常见的TP53 突变来进行。同样，在人胆管细胞类器官中的CTNNB1 外显子3中引入常见的阅读框内缺失会产生突变类器官，该类器官可在没有外源性Wnt的情况下生长。这些结果突出了无DSB基因工程在类器官中用于癌症建模的效果。
  除了癌症相关研究外，CRISPR与ASC衍生的类器官的联合应用很多。其中一个例子是创建肠道类器官中DGAT1损失的等基因模型作为先天性腹泻病的模型，导致突变类器官比对照组更容易受到脂质诱导的细胞死亡的影响。另一个例子包括全基因组阳性CRISPR筛选，用于研究导致小鼠溃疡性结肠炎的混杂因素。此外，类器官是研究2019年大流行导致严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的绝佳模型。
  评估CRISPR介导的基因修复
  由于ASC衍生的类器官比2D细胞系更类似于其起源组织，因此更有望在体内应用前先绘制出体外治疗性基因工程的有效性和安全性，为患者基于CRISPR的基因组工程提供更准确预测。此外，ASC衍生类器官的移植可作为全器官移植的补充。出于安全目的，体外CRISPR修复的自体类器官在通过全基因组测序进行严格的脱靶测定后，同样可以移植回患者体内。
  1. 囊性纤维化
  使用CRISPR-Cas9介导的基因工程在人类干细胞中修复的第一种遗传性疾病是囊性纤维化。囊性纤维化由CFTR基因的各种突变引起，最常见的是苯丙氨酸-508缺失（F508del）。ASC衍生的肠道类器官模拟CFTR通道的功能，与临床疾病严重程度相关。对共转染的Cas9进行基于测序的筛选，发现89个测序的类器官克隆中有17个（19.1%）校正了F508del突变，这些修复的类器官将毛喉素诱导的肿胀反应恢复到野生型水平。另一种策略是修复破坏CFTR功能的有害剪接位点突变：3272-26 kb A>G和3849 + 10 kb C>T。而不是直接修复点突变，可通过使用Cas12a来选择突变的等位基因特异性破坏。
  随后研究人员建立了一个肠道类器官生物库，其中包含664个类器官系，代表154个不同的CFTR突变。从该生物库中，选择了可以通过SpCas9-ABE修复的类器官。携带R785*突变的肠道类器官用碱基编辑试剂转染，约9%的转染类器官实现功能修复。通过使用xCas9-ABEs修复肠道和上气道类器官中的R553*、R1162*和W1282*突变，增加了碱基编辑器介导的CFTR修复空间。同样，肠道类器官中的先导编辑允许对F508del突变进行无DSB修复。在CFTR修复后，通过碱基编辑和先导编辑对肠道类器官进行全基因组测序，发现没有全基因组脱靶，这是无DSB基因组工程用于治疗目的的安全性基础。为了提高先导编辑的体外编辑效率，研究人员开发了一种名为fluoPER的荧光先导编辑和富集报告基因，可使CFTRF508del的修复效率提高到80%，能够修复难以捉摸的CFTRG542*突变。
  在患者来源的等基因肠道类器官中应用先导编辑可以恢复DGAT1，c.629_631delCTT，p.s210del中最常见的突变，该突变会导致脂滴中脂肪酸储存缺陷。在修复威尔逊氏病患者肝类器官中ATP7B突变的实验中也观察到了类似的结果。随后，使用FluoPEER系统有效地纠正了负责肝内胆汁淤积症的ABCB4和ATP8B1突变。
  CRISPR工程的同基因类器官也可用于研究原发性纤毛运动障碍疾病。使用类器官分化方案能可视化原发性纤毛运动障碍患者气道类器官中的纤毛缺陷。从患者来源的类器官的迷你生物库中，携带纤毛基因DNAH11剪接突变的类器官可以使用先导编辑进行修复，效率高达85%。
  技术注意事项
  由于传统和下一代CRISPR工具主要为2D细胞系开发，因此向3D细胞培养物的转化并不简单。在使用ASC衍生的类器官创建同基因疾病模型之前，需要解决关键因素。
  1. 正确的基因编辑工具
  为了规避传统CRISPR-Cas9不必要的靶向和脱靶效应，建议使用下一代CRISPR工具——碱基编辑和先导编辑。CBE可以有效地用于在基因中引入终止密码子，介导C•G到T•A碱基的变化，将精氨酸（CGA到TGA）、谷氨酰胺（CAA/CAG到TAA/TAG）和色氨酸（TGG到TAG/TGA/TAA）转化为终止密码子。根据CRISPR-STOP方法，由于CBE不需要DSB，因此观察到较低水平的细胞凋亡，导致细胞在转染基因编辑组件时压力较小。如果没有合适的sgRNA可用于CBE介导的终止密码子的引入，则ABE可用于破坏起始密码子或剪接位点，以有效地创建基因敲除。重要的是，使用CRISPR-STOP能实现更有效的基因分型过程。
  研究人员建议在设计ABE介导的方法之前，首先设计CBE介导的终止密码子插入，因为由于替代剪接或使用替代起始位点，细胞仍然可以表达感兴趣的蛋白质。在碱基编辑器中，DNA改变的融合蛋白会在特定序列环境中起作用。此外，碱基编辑器在编辑窗口中最有效。如果需要特定的编辑，但在编辑窗口中编辑额外的核苷酸会导致不需要的氨基酸变化，则先导编辑是首选策略，因为可以将RT模板设计为包含感兴趣编辑。
  2. 递送和筛选
  将基因编辑剂递送到类器官中会比递送至2D细胞系困难得多。在HEK293T中，质粒DNA的简单脂质化转染效率可高达95%，而3D类器官的效率在每条生产线上差异很大，可低至1.5%。慢病毒转导可能是一种更有效的策略。然而，即使滴定得当，病毒基因组也容易多次整合，可能会影响类器官的适应性。将核糖核蛋白复合物电穿孔成类器官可显著提高转染效率，但会降低灵活性。
  类器官的低转染效率不会限制成功的同基因模型生成，只要在实验设置期考虑合适的转染或功能编辑类器官的筛选策略即可。对于功能筛选，根据引入的遗传变异选择CRISPR工程类器官，该变异可以基于生存能力或基因组工程的表型变化。如果没有可用于所需编辑的功能筛选，则转染筛选是首选策略。可以通过基于荧光的FACS分选或整合到基因编码序列中以产生敲除时获得的抗生素耐药性，或通过共转染潮霉素耐药性piggyBac进行选择。
  类器官中基于CRISPR的基因工程在未来疾病建模和患者护理方面具有巨大前景，新型基因工程技术的快速发展允许对日益复杂的DNA突变进行可扩展诱导，进一步突出了CRISPR在ASC衍生类器官中的适用性。
  目前已经开发了复杂的ASC衍生的同基因疾病模型来揭示疾病进展的机制，CRISPR和ASC衍生类器官的组合也可能有利于基因工程的临床转化。ASC衍生的类器官可以解决安全问题，因为基因修复可以在离体进行，然后进行严格的脱靶分析。
  此外，ASC衍生类器官的移植可作为全器官移植的补充。尽管目前移植到人类体内并不常见，但ASC衍生的类器官已经可以提高基因工程技术的安全性，应用CRISPR作为治疗策略的临床试验已经开始。