text: 【五分钟讲实验】血管生成实验技巧及研究思路
  血管生成（Angiogenesis）是从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，其对于器官生长、胚胎发育和伤口愈合在内的多种过程十分重要。1. 血管萌发：血管生成的第一步是血管内皮细胞的分化和转化为成熟血管的前体细胞，这些细胞称为“血管萌发点”。2.血管延伸：血管萌发点开始向周围细胞或组织延伸。该过程可能涉及被称为“引导策略”的信号分子，以帮助方向性移动。3.血管融合：在不同位置生长的血管可能会相互靠近起来。这些血管随后会通过一系列复杂步骤融合，形成全新的循环系统。4.血管变化：一旦形成，成熟的血管可能会改变其形态和结构以适应环境。例如，某些部分可能需要增加灵活度，以便在控制血液流量时避免大气压力，同时其他部分可能需要增加强度和稳定性以支持负重。研究人员可使用多种方法来研究血管生成过程，包括杂交瘤模型、血管形成实验、鸡胚膜血管生成实验、管腔形成实验、小鼠Matrigel注射、兔角膜血管生成实验等。不同血管生成实验方法对比不同实验方法研究应用及机制通路血管生成与新生参与了许多疾病的发生、演变和进展，包括最常见和致命性心血管疾病、癌症、糖尿病、炎症及眼科疾病等。1. 癌症恶性肿瘤是最突出和研究最广泛的血管生成异常疾病之一。肿瘤通过高表达各种血管生成因子和细胞因子，同时下调内源性血管生成抑制因子来触发血管生成，从而逃避免疫系统和治疗措施的攻击。迄今为止，大多数临床上治疗肿瘤的抗血管生成药物都是通过靶向VEGF-VEGFＲ-2信号通路研发的。抗血管生成药物应用于临床抗肿瘤治疗近20年，但仍有几大难题尚未解决:①对大多数类型癌症生存获益有限;②抗血管生成药物单药治疗对大多数癌症无效;③原发性与继发性耐药的发生;④缺乏有效区分获益人群的标志物;⑤最佳治疗时间仍不确定;⑥与其他抗肿瘤药物联合应用的合理性。从机制上深入理解这些问题将为改善癌症患者的治疗结局提供重要线索。研究表明仅阻断VEGF-VEGFＲ信号可能不足以在癌症患者治疗中取得重大突破。研发针对其他血管生成途径如成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)和血管生成素(Ang)的治疗药物，并与抗VEGF治疗联合应用可能是其互补策略和研究思路。2. 眼部疾病眼科疾病的发生和发展与新生血管生成密切相关。老年性黄斑变性(AMD)和糖尿病性视网膜病变(DR)是最常见的眼部血管疾病，也是成年人失明的主要原因。视网膜中过多的新生血管生成是由局部低氧环境诱导血管生成因子过度产生所导致。VEGF是视网膜中关键的乏氧诱导血管生成因子。目前，临床上广泛应用雷珠单抗和阿柏西普作为治疗AMD的抗血管生成药物，其治疗效果在提高视力方面具有压倒性优势。这些药物的临床获益机制主要是降低VEGF诱导的血管通透性，这是导致视力损害的关键病理过程。3. 心血管疾病血管生成与血管供应紧密相关。心肌缺血时，器官需要更多的氧气和营养物质，因此心肌细胞会分泌一定量的VEGF刺激血管新生，以提供更多的氧气和营养物质。心肌梗死后梗死心肌中功能性血管网络的重建将为缺血性心脏病的治疗提供新的手段。通过预防脑卒中患者局部病变的血管渗漏而使脑血管正常化也可能改善脑复苏和死亡率。4. 帕金森病帕金森患者的大脑中新生神经元数量减少,容易造成失调,经过一些研究发现，增加血管因子浓度可促进神经元增殖并对协调运动有益。5. 代谢性疾病如肥胖和2型糖尿病(type-2diabetes，T2D)。与肿瘤生长相似，脂肪组织的扩张也依赖于血管生成，抑制血管生成可能会抑制或预防肥胖。在抗血管生成药物治疗的肥胖动物中，将VEGF和PDGF输注至脂肪组织可以显著改善肥胖动物的代谢紊乱，随着脂肪组织质量的减少，代谢参数包括胰岛素敏感性、血糖水平和血脂谱也得到了改善。 6. 其他疾病慢性炎症如牛皮癣和风湿性关节炎也依赖于血管生成。各种炎症细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)都含有促血管生成的成分，靶向这些细胞因子的药物在治疗炎症性疾病时必然会抑制血管生成。1. 血管形成实验的基本原理是什么？内皮细胞保留了分裂和快速迁移的能力，可响应血管生成信号。2. 哪些细胞可以进行血管形成实验？多种类型的内皮细胞均可用于本实验，包括原代细胞和永生化细胞系。常用的有人脐静脉内皮细胞（HUVEC），之所以不采用静脉血管内皮细胞与动脉血管内皮细胞是因为HUVEC具有干细胞的潜能，理论上可以传代50-60次。此外小鼠3B-11细胞、小鼠SVEC4-10细胞或原代内皮细胞也可用于血管形成实验。3. 实验操作步骤1.实验前准备基质胶的准备：A.提前一天将Matrigel置于冰盒中，放入4℃冰箱过夜，使胶能过夜缓慢融化。（注意：同样要准备一些4℃预冷的枪头,EP管，96孔板);B.分装：第二天待Matrigel冻融后，准备进行分装，Matrigel用预冷枪头混匀，分装300ul/管到提前预冷的EP管，在操作过程中要将Matrigel始终保持放在冰盒中；C.铺胶：96孔板放在冰盒上，取50ul/孔Matrigel基质胶滴加到96孔板中，加入时避免产生气泡，加完稍微摇晃均匀先在4℃冰箱放置20-30min后，再放入细胞培养箱中60min待其凝固。2.实验步骤1.内皮细胞达到80%汇合度后准备消化，收集细胞进行计数，并按照需求稀释调整细胞的密度（初次实验设置细胞密度建议：5~10×10^4个细胞）；2.96孔板加入100ul的细胞悬液，做好标记后放入细胞培养箱常规培养；3.细胞常规培养4h至24h期间在镜下观察并拍照（建议观察时间：14~18h）。4.结果分析。3.血管生成图：4. 注意事项1.加基质胶一定垂直悬空滴入孔底部，避免沾到孔板壁上，移液枪到达第一档，减少气泡产生，使用摇晃的方法让胶均匀分布。2.滴加细胞悬液时垂直加入，避免戳到下边的凝胶。3.铺胶或分装前需要准备一些4℃预冷的枪头,EP管，96孔板。关注公众号，了解更多！