text: 结直肠癌进化的遗传和非遗传机制
  结直肠癌是全球癌症相关死亡率和发病率的主要原因。关键驱动突变的逐步积累是导致结直肠癌原发部位发生和恶性进展的原因。crc相关死亡的主要原因是转移和复发，因为即使在手术切除和新辅助治疗后，它也经常扩散到肝脏和肺部。已经确定，CRC的进展是通过遗传改变的逐步积累，这是一个已知的多步骤肿瘤发生的概念。然而，癌症的进化不仅受到基因改变的调控，也受到非遗传机制的调控。这篇综述讨论了遗传改变在原发性肠道肿瘤恶性进展中的作用，以及我们从模型研究中了解到的负选择和多克隆转移的非遗传机制。高通量测序技术不仅可以识别与CRC发展相关的基因组和转录组学改变，还可以揭示相当大的ITH（瘤内异质性）。异质性导致克隆细胞群之间复杂的相互作用，引起癌症的进化，如转移、复发和耐药性。然而，有报道称原发性和转移性CRC之间没有根本不同的遗传改变，这表明非遗传机制促进了转移的发生。原发性结直肠癌的基因转换方案APC和Wnt的激活引发CRC的发展：Wnt、MAPK/ERK、PI3K、p53和TGF-β通路的遗传改变是结直肠癌发生的主要媒介。Wnt信号在维持正常肠道干细胞的干性中起着至关重要的作用，并且在大多数结直肠癌细胞中普遍失调。几乎75%的结直肠癌病例有APC突变，导致组成型Wnt信号激活，导致肠内腺瘤性息肉的发展(图1)。在携带Apc截断716密码子突变的ApcΔ716小鼠(A)中，从遗传学上证实了Apc突变与肠息肉病的因果关系。有趣的是，Apc突变并不足以导致息肉的发生，但通过产生炎症微环境，诱导基质细胞中COX-2的表达和随后PGE2信号的激活是肿瘤发生所必需的，因此COX-2/PGE2途径可能是预防CRC的可能靶点(图1)。组成型Wnt信号激活也可由RNF43突变诱导。RNF43的功能缺失突变导致R-spondin无法通过蛋白酶体途径降解Wnt受体，从而增加对Wnt配体刺激的敏感性。一项CRC患者来源的类器官分析表明，在msi阳性和CIMP(CpG岛甲基化表型)阳性的CRC中发现了RNF43突变，这表明APC突变引发的CRC的恶性进展有不同的遗传机制。此外，该研究还表明，一种Wnt配体抑制剂可以有效地抑制RNF43突变型CRC衍生类器官的患者来源的异种移植(PDX)肿瘤的发展，这表明Wnt配体抑制msi型CRC的可能治疗策略。p53功能获得性突变导致恶性进展除了APC失调外，一项全面的基因组分析显示TP53(60%)和KRAS(42%)的突变发生率很高，它们与APC突变共同驱动恶性进展。p53通过调控细胞周期阻滞、DNA损伤修复、细胞凋亡、免疫应答等多种生物学过程发挥抑瘤作用。CRC中大多数TP53突变是错义突变，不仅损害了p53的功能，而且通过GOF机制在p53中发挥新的致癌作用，如增加干性、侵袭性和转移性。为了研究GOF突变体p53R270H(对应人类R273H)在肠道肿瘤发生中的作用，我们生成ApcΔ716 Trp53R270H复合小鼠(AP)，发现突变体p53R270H诱导肠道肿瘤粘膜下侵袭(图1和2)。与此一致的是，Trp53 R270H突变的肿瘤源性类器官具有侵袭性，这与类器官复杂的腺体结构有关。转录组分析显示，GOF突变体p53可激活Wnt/β-catenin信号和炎症途径，可能是通过增加启动子可及性，这可能有助于获得侵袭性。Kras和Trp53 GOF突变联合导致恶性进展致癌KRAS突变赋予MAPK/ERK和PI3K信号组成性激活，导致细胞增殖、存活、迁移和侵袭增加，这与CRC患者预后不良相关。然而，我们在ApcΔ716 KrasG12D化合物小鼠肿瘤中未发现晚期恶性表型。相反，Kras突变显著增加了肠腺瘤性息肉的数量。Kras激活可诱导COX-2表达，从而加速炎症微环境的生成，支持肿瘤细胞的存活和增殖(图1)。值得注意的是，ApcΔ716 KrasG12D Trp53R270H三突变(AKP)的组合在粘膜下浸润病变处诱导了pEMT和内渗，而在ApcΔ716 Trp53R270H双突变小鼠中没有发现这种情况。与此一致的是，另一个遗传模型也表明，致癌Kras突变对息肉生长是不必要的，但对浸润性和转移性生长很重要。值得注意的是，来源于ApcΔ716 KrasG12D Trp53R270H小鼠肠道肿瘤(AKP)的类器官在移植到脾脏后发生肝转移瘤，而具有任意两个突变的类器官则没有发生肝转移瘤(图1)。因此，这些结果表明APC、KRAS和TP53的突变是CRC恶性进展和转移所需的最小组合。通过Kras突变和TGF-β通路抑制恶性进展TGF-β通路下游组分的改变参与了结直肠癌的发展。TGF-β信号通过诱导上皮细胞分化和抑制生长，发挥抑瘤作用。同样，编码TGF-β通路重要下游效应子的SMAD4和TGF-β II型受体基因TGFBR2的突变在非高突变或高突变的CRC病例中经常被检测到，并且与促进转移性状的发展有关。值得注意的是，抑制结肠粘膜TGF-β信号不仅通过上皮转化，还通过肿瘤-基质相互作用驱动肿瘤进展。例如，在ApcΔ716和Tgfbr2−/−或Smad4−/−小鼠肠道肿瘤(AT)中产生具有蛋白酶表达的炎症和纤维化微环境，从而促进粘膜下侵袭表型(图1)。此外，ApcΔ716 KrasG12D Tgfbr2−/−复合小鼠(AKT)的肠道肿瘤显示出pEMT和体内浸润，肿瘤源性类器官的脾脏移植诱导肝转移的发生率和多样性增加(图1)。因此，这些结果表明APC、KRAS、TGFBR2或SMAD4的突变是CRC转移的另一个最小核心。值得注意的是，TGF-β信号也可以作为肿瘤启动子，因为它在CRC的晚期高度表达，因此TGF-β被认为是癌症发展中的一把双刃剑。癌症的进化决定了转移能力Trp53 GOF突变与LOH联合转移与小鼠模型研究结果一致，与任何两种突变相比，KRAS/NRAS、TP53和SMAD4联合突变与肝转移手术切除后的复发和更差的生存率相关。特别是，TP53突变在结直肠癌的肝转移中定量富集。GOF突变体p53通过与染色质重塑复合体或组蛋白修饰的相互作用在表观遗传调控中发挥作用，这可能通过增加启动子可及性来促进恶性特性的获得。为了进一步研究GOF突变型p53在转移中的机制，我们从ApcΔ716 KrasG12D Tgfbr2−/−Trp53+/R270H四突变小鼠(AKTP)中建立了肠道肿瘤源性类器官，称为AKTP+/M细胞(注意Trp53基因型为杂合+/R270H)。正如预期的那样，当AKTP+/M类器官移植到脾脏时，出现了多个肝转移灶。然而，重要的是，在大约50%的肝转移病变中，肿瘤细胞通过LOH丢失野生型Trp53基因，成为AKTPR270H/LOH(以下简称AKTPM/LOH)。相比之下，野生型Trp53在脾移植原发肿瘤中保留。这些结果表明，LOH丢失野生型Trp53对促进转移发展很重要(图2)。研究发现，野生型p53干扰杂合细胞中突变型p53蛋白的核稳定，因此p53 LOH是突变型p53稳定致癌功能的重要前提。事实上，与AKTP+/M和AKTP−/−细胞相比，AKTPM/LOH细胞显示出更高的存活率和单个解离细胞的克隆扩增，这是远处器官中休眠播散细胞的重要特性(图2)。综上所述，这些模型研究表明，杂合的GOF p53突变诱导原发部位的粘膜下侵袭，而p53的额外LOH通过稳定GOF突变p53有助于转移的发展(图2)。Kras和Trp53联合突变导致转移AKTP类器官细胞的基因表达分析表明，Trp53 GOF/LOH突变诱导生长因子/MAPK和炎症通路信号上调，这可能导致Apc、Kras和Tgfbr2突变获得高转移能力(图2)。结果还表明，GOF突变体p53通过激活MAPK通路增强KRAS的致癌反应。在胰腺导管腺癌中，突变型p53和KRAS之间也有类似的协同作用，其中突变型p53失调了gap的选择性剪接，从而促进了KRAS的最大激活。因此，有人建议纠正GAPs中的错误剪接事件是治疗同时存在KRAS和TP53突变的肿瘤的潜在策略。不涉及多步骤肿瘤发生的癌症进化驱动突变的积累促进了原发性结直肠癌向恶性发展的进化速度。同时，在恶性进展过程中，遗传改变产生ITH，具有不同的适应TME的能力。CRC组织多个区域的测序表明，主要驱动突变在CRC发展的早期阶段积累，随后的ITH通过中性进化机制发展。此外，CRC发展的大爆炸模型提出，肿瘤在早期生长阶段呈指数增长，在CRC中产生高度的ITH和亚克隆混合。有研究表明，ITH参与了肿瘤的进展和转移，与多步骤肿瘤发生模型有明显不同。然而，关于ITH潜在的恶性进展和转移的确切机制的细节仍不清楚。Positive selection vs. negative selection通过遗传改变获得的获得性恶性表型的正向选择促进了癌症的进化。利用高度转移的AKTPM/LOH类器官，我们最近证明了负选择在维持肿瘤细胞群的恶性表型中的潜在作用。令人惊讶的是，大约30%的AKTPM/LOH肿瘤衍生亚克隆显示转移能力丧失，尽管携带与亲本细胞相同的驱动突变，下游激活β-catenin, p53和ERK1/2通路(图3A)。高转移亚克隆在肝脏中产生一个转移生态位，Stat3激活，而非转移亚克隆则不会。Stat3对于正常肠道干细胞的存活和扩增至关重要，因此在微转移的发展中起着重要作用。此外，RNA测序结果表明，转移性AKTPM/LOH细胞中的干细胞相关基因，包括Lgr5和Myb，在非转移性亚克隆中下调(图3A)。最近的一项研究表明，在肠道肿瘤来源的类器官移植后，表达lgr5的细胞的缺失可以阻止小鼠肝转移的发展，这表明干细胞的增加对转移能力很重要。值得注意的是，在胶原凝胶上共培养时，失去转移能力的亚克隆逐渐从亲代细胞群中消除(图3B)。因此，在癌细胞群中，非转移性亚克隆的比例可能会不断上升和下降。综上所述，这些发现表明肿瘤细胞的进化和恶性特征的维持可能受到正选择和负选择的调节。因此，了解癌细胞转移能力丧失的非遗传机制可能有助于开发新的治疗策略来对抗转移扩散。亚克隆之间的相互作用促进转移：异种移植研究的结果表明，亚克隆对癌症恶性进展有重要的相互作用。遗传异质性亚克隆的多克隆转移：大多数关于多克隆转移的研究都使用具有相同或相似遗传背景的差异标记癌细胞。为了阐明具有遗传和表型变异的多克隆转移机制，我们通过联合注射非转移性(ApcΔ716 Trp53R270H双突变类器官，AP细胞)和转移性肠肿瘤源类器官(四突变类器官，AKTP细胞)进行了脾脏移植实验。重要的是，非转移性AP细胞与转移性AKTP细胞共移植时，能够在肝脏中形成转移性肿瘤(图4A-C)。当AP细胞通过不同的注射途径独立于AKTP细胞移植时，AP细胞对转移灶没有贡献，这表明与转移细胞的共播散是多克隆转移所必需的。虽然非转移性细胞可以通过多克隆机制转移，但恶性程度较低的细胞的增殖应该依赖于转移灶中恶性程度较高的细胞。然而，重要的是，如果实验中从多克隆转移性病变中去除AKTP细胞，非转移性AP细胞能够存活并继续增殖形成大肿瘤。因此，如果肿瘤病灶同时包含KRAS突变阳性和突变阴性细胞，靶向突变KRAS可能不足以治疗转移性肿瘤。因此，在考虑有效的治疗策略时，了解转移灶的遗传异质性是重要的。肿瘤微环境调控多克隆转移肿瘤微环境中的癌症相关成纤维细胞TME是一个多细胞系统，包括免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞。CAFs是TME中最丰富的基质细胞之一，CAFs（癌相关成纤维细胞）数量的增加通常与不良预后相关。最近对结直肠癌肿瘤的分析定义了CAF亚型，包括myCAFs（染色CAF）和iCAFs（炎症CAF）。MyCAFs的特点是产生基质的收缩和高度增殖表型，它们包含作为保护癌细胞免受免疫细胞和药物攻击的物理屏障的ECM网络。myCAFs还通过与癌细胞的直接或间接相互作用促进肿瘤发生。相比之下，iCAFs表现为分泌型表型，主要与肿瘤细胞通过免疫抑制细胞(如MDSCs和Tregs)的化学吸引而逃避免疫有关。使用小鼠肠道肿瘤源性类器官，我们发现成纤维细胞在肝窦中被阻滞的AKTP细胞周围增殖，并且在转移灶中产生了胶原纤维沉积的纤维化微环境(图4A,C)。这种α- sma阳性的CAFs可能是myCAFs，起源于肝星状细胞(hsc)，如果将非转移性AP细胞阻滞在肝窦中，则无法观察到这种细胞(图4B)。进一步证明，如果白喉毒素处理使转移病变中的AKTP细胞耗竭后，纤维化生态位得以保留，则非转移性AP细胞可以存活并在肝脏中定居(图4D)。因此，CAFs诱导的恶性细胞诱导的纤维化生态位是非转移细胞多克隆转移的重要机制。TGF-β是一种负责HSC活化和肝纤维化的细胞因子。正如预期的那样，转移性AKTP细胞在Tgfbr2基因敲除小鼠的肝脏中没有诱导纤维化生态位的产生，并且转移的发展也被显著抑制。也有研究表明，基质TGF-β信号的增加可以提高CRC细胞的存活和转移定植，表明抑制TGF-β信号可以抑制转移进展。也有研究表明，靶向TGF-β信号通过激活抗肿瘤免疫来抑制转移性肿瘤的发展。结论综合基因组分析揭示了CRC的主要驱动突变及其异质性特征。小鼠模型研究揭示了原发性肿瘤恶性进展过程中基因改变与输出肿瘤表型之间的关系。此外，类器官移植实验表明，肿瘤细胞与宿主反应相互作用，由CAFs产生纤维化TME，促进多克隆转移。由于CRC的异质性及其在转移过程中与TME的多克隆相互作用，迫切需要了解准确的遗传和非遗传癌症进化机制，以便为转移性CRC提供精准医学治疗。