text: 微载体的培养工艺（上）- 微载体培养基和简易培养工艺
  现今的生物技术产品生产最迫切的要求是更快的速度、更低的成本和更多的适应性，动物细胞培养被持续不断地开发以提高单位细胞的生产力，从而使动物细胞产品的成本更有竞争力。随着操作规模的增大，物力和人力的投入也大大增加。细胞培养的条件也更加重要，一旦培养失败代价将更为惨重。培养基中有两个对细胞粘附到培养表面至关重要的因素：二价阳离子和培养基中或者吸附到培养表面的蛋白。许多传代的和转化的细胞类型只能分泌极少量的纤粘连蛋白，因此需要在培养液中添加纤粘连蛋白或者血清以促使粘附的发生。开始培养时，非常实用的方法是在加入细胞之前让培养表面与含有血清的培养基接触一段时间。无血清培养基常常需要添加纤粘连蛋白（1-50ug/ml），才能促使大多数的细胞粘附到培养表面。培养程序影响到细胞粘附到表面速率。当选择一种培养基用于微载体培养时，最合适的起始点是之前有报导能够支持那种细胞类型的生长，一旦确定了一种细胞类型在微载体培养中的基本程序，可能需要改良培养基来得到最大的产量。微载体培养的起始阶段常常需要一种营养丰富的培养基，尤其是使用低细胞密度时。当以低密度启动培养时，199培养基常常导致比DME或者BME更高的平板效率和更好的产量。当培养低或中等平板效率（少于30%）的细胞时，在起始阶段使用DMEM培养基直到需要补充培养基时。非必需氨基酸是改进平板效率和低密度生长的一个最重要的补加物。在培养的细胞密度非常高时（高于3×106cells/mL），或者培养的细胞在培养周期的后面步骤中快速分裂时，补给的培养基都添加有肌醇和胆碱。如果补给培养基只含有低浓度的血清时，提高肌醇和胆碱的浓度是很重要的。以下评价载体培养程序中各营养成分的消耗和吸收情况：TransVA-01培养基适合BHK21细胞的悬浮驯化、BHK21全悬浮细胞的传代、生长和接毒。同时，该培养基搭配1-3%血清适合培养Vero、MDCK、 PK-15、Marc-145等细胞的贴壁培养。TransVA-01培养基无动物来源成分、无蛋白成分。该粉末培养基含有L-谷氨酰胺。图1：多宁生物疫苗培养基TransVA-01订货信息氨基酸：半胱氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸和丝氨酸是利用最快的氨基酸，各种类型细胞首先耗尽的通常都是这些氨基酸。在许多培养过程中常常出现限制性的氨基酸供应，如果要得到高的细胞产量应该避免氨基酸水平的浓度限制和不平衡。唯一的例外是谷氨酰胺和半胱氨酸，它们需要以不同于原始培养基形式的浓度补加。Gln在细胞代谢过程中起着重要的作用，它是核酸合成的前体，也是一种重要的碳源。在培养起始阶段将谷氨酰胺的浓度提高到2.5 mM通常能产生更好的细胞生长，尤其是在低细胞密度的情况下，连续补加谷氨酰胺是很重要的，这种氨基酸对涉及细胞底物粘附的分子的形成可能起作用。Cys的最适浓度很大程度上依赖于血清浓度和分批。如果使用低浓度的血清，可能需要减少半胱氨酸的浓度，对于一般的微载体培养，原始培养基中提供的半胱氨酸水平是足够的。核酸前体：大多数培养基含有1-4mg/mL的叶酸，但是199培养基含有的只是这个量的1/100。在一些情况下，例如在用199培养基进行原代细胞或者正常二倍体细胞培养时，加入额外的叶酸或者胸腺嘧啶可能是必要的。碳源和乳酸：在大多数通常使用的培养基中，碳源是由葡萄糖（5-20mM）和谷氨酰胺（0.7-5mM）提供的。维生素和胆碱：加入类维生素A能够促进对底物粘附力较弱的细胞的粘附。胆碱主要的命运是结合到磷酸脂膜上，当胆碱浓度下降时，膜组分出现，混乱引起细胞变圆并脱落。当使用低浓度血清（低于5％）时补给额外的胆碱是很重要的。聚合物：在接种后的早期阶段向培养基中加入一种聚合物是非常有利的。聚合物提高了细胞的存活率，但是对其生长没有作用。当培养的细胞类型很微弱地粘附到培养表面时，例如一些传代细胞系如成淋巴细胞等，可用Ficoll400来减少湍流。血清的选择和浓度：对于动物细胞培养而言，血清主要起到两个作用。首先，它帮助细胞粘附到培养表面，可能通过提供粘附过程涉及的外源糖蛋白起作用。第二个是血清中的生长因子和激素促进了细胞的增殖。考虑到成本高效的微载体培养（尤其是用于生产的）需要一个弹性的方法来选择血清。可以采用几种不同的策略选择一种或者几种血清，就能在维持高的细胞产量时大量减少血清的成本。逐渐降低血清浓度使细胞经过一定时期的适应或者“驯化”就可能在减少血清浓度的培养中改进细胞的生长：微载体培养中的一个典型过程是在培养的前3天（或者直到细胞将近1-3×105cells/mL）用10％的血清，然后用只有5％血清的培养基更换。一旦培养长到汇合，血清的浓度可以降到0.5%。有研究表明可以通过降低血清浓度来避免长到汇合的细胞单层的脱落。培养周期的不同阶段使用不同的血清：由于不同的血清辅助细胞粘附和促进细胞增殖的能力是不同的，最好的添加方式将有赖于细胞培养周期的阶段。血清在低细胞密度的条件下促进细胞粘附和生长的活性可以在培养的初始阶段利用。辐射灭菌：对干粉微载体进行伽玛辐射（2.5兆拉德）来灭菌。蒸汽灭菌：当微载体在无Ca2+,Mg2+的PBS中膨胀清洗3次以后，用高压蒸汽灭菌系统对微载体灭菌。溶剂灭菌：当微载体在无Ca2+,Mg2+的PBS中膨胀后，再用70%乙醇水溶液洗涤微载体两次，然后在此70%乙醇溶液中放置过夜。然后移除乙醇溶液用无菌的无Ca2+,Mg2+的PBS润洗三次。培养条件平衡：确保培养在接种前就已经平衡，这样可以使得接种的细胞达到最大可能的平板效率。吸出无菌微载体中的PBS，用35-37℃预热的培养基润洗2~3次。调整培养基的温度到适合于细胞的粘附的水平。小培养体积、含有培养基的培养容器可以在含有5% CO2的培养箱中于37℃温育平衡。搅拌可以加速气体交换过程（平衡气体）。非常大体积的培养可能需要2-3小时才能平衡。推荐平衡过夜。载体浓度和接种负载量：在大多数情形下，微载体用在搅拌培养中使用的浓度为0.5-5.0 mg/mL。如果培养基的供应是充分的，而且气压和pH是控制的，有可能在高于5mg /mL的情况下进行培养，有时可以达到5-10×106cells/mL。【注】：如果培养周期的后期在维持培养条件方面有困难，或者不能够有效地供应营养物质，建议考虑降低微载体的浓度。在0.5-5mg /mL终体积的范围内，在培养的平台期负载有细胞的微载体的比例（即细胞产量）与微载体的浓度相关。如果必须使用低的微载体浓度，可以通过改进前面提到的起始培养程序来提高培养平台期负载细胞的微载体的比例，从而提高细胞产量。如果要最大程度利用微载体，每个微载体上大约需要负载10个人类成纤维细胞，或负载5个猴肾细胞。例：Cytodex的接种平均密度是2×105/mL培养体积，对于大孔微载体如Cytopore和Cytoline，接种密度应当为2×106/mL沉降载体就可以从平板效率或小规模的接种密度实验推断出更低的密度。微载体培养应当尽可能地接种处于活跃的有丝分裂期，大约长至70-80%汇合的细胞。按照这个方法，将有更多比例的细胞粘附到微载体上，更有利于培养的生长。当浓缩接种体时，应避免过度的离心，因为容易造成重悬时细胞的聚集和活力的下降。一般在200-300g离心5min就足够了。用培养用的培养基重悬细胞可以避免稀释培养基的组分，也可以避免接种体细胞遭受温度，pH或者渗透压的突然改变。图2：多宁生物实验室疫苗细胞微载体培养培养过程条件起始搅拌：大多数培养开始时，细胞和微载体都在1/3终体积中培养。每隔30min以生长期使用的搅拌速度搅拌2min。3-6小时之后，推荐使用恰好能够保持微载体悬浮的搅拌速度连续搅拌，并且加入预先温热（37℃）的培养基增大体积。原代上皮形态的细胞通常需要较长的粘附时间。对于低平板效率（低于10%）的细胞，或者以非最适数目接种的细胞，在培养的前3天，培养体积可以保持在50%最终体积，之后加入新鲜的培养基至最终体积。以这种方式，细胞的数目可以在最容易稀释的培养阶段培养到更大的密度。培养维持：（1）搅拌速度：应当能够刚好有效地保持所有的微载体处于悬浮状态。在通常间隔搅拌或者静止粘附的起始培养时期之后，应当连续地搅拌。当微载体培养用于生产病毒或细胞产物时，通常在生产时期应当降低搅拌速度。大多数情况下，将速度降低到生长时期搅拌速度的一半是最理想的状态。（2）培养基的补给：通常的程序是开始每3天更换50%的培养基。当取样时，可以用新鲜的培养基更换10-20%的培养体积。为了利用条件效应，在培养的头2天内不应当更换培养基。当维持微载体上汇合培养时，务必考虑以下几点:pH。维持优化的培养条件pH是很重要的，一旦发生pH的波动细胞易于脱落。渗透压。当pH通过加入酸/碱或者缓冲液进行控制时，避免渗透压的改变。血清浓度。最通常的维持细胞汇合培养的途径是减少添加的血清的浓度。对于接触抑制微载体细胞培养而言，需要从通常的添加5-10%减少到2-5%。对于汇合后仍然能够连续分裂的细胞来说，应当考虑更低的血清浓度（降低到0.5%）。培养基换液。营养物质的浓度应当尽量维持恒定，而且应当避免有毒代谢产物的积累，每天更换10-20%的培养液常能达到最好的效果。每天添加低浓度的Gln比添加含有高浓度Gln的培养液更能避免不必要的氨和有毒产物的积累。抗生素。对汇合培养的长期维持而言，尽量在培养基中减少抗生素的浓度。控制和补料策略：在简单的细胞培养过程中，取出微载体样品，计数细胞，观察细胞形态来记录细胞的生长。随着细胞的增长，提高搅拌速率以补偿微载体重量的增加（空载体1.03g/mL，细胞1.015-1.070g/mL，与细胞类型有关）。这将保持细胞悬浮并增加气体传递。培养3天后，培养基变酸性，应当换液。放大培养放大的一个基本部分是每一步放大步骤中细胞的倍增。如果可能以低细胞密度接种，例如104/mL，而且最终产量达到106/mL，则细胞倍增因子是100倍。每一步放大到最终生产体积的倍增因子越大，则达到目标的所需的步骤就越少。如果按照上面的应用，就可能用1L的spinner接种100L的发酵罐。在拓殖的情况下，1L的spinner可以接种1000L的发酵罐。参考文献：微载体细胞培养 ——原理与方法 ，孙李靖 译.*详细产品信息，请联系marketing@duoningbio.com