text: 2023IFSCC论文分享：多组学研究对亚洲族群皮肤老化的皮肤屏障新见解
  摘要为了研究不同年龄组的临床皮肤参数、皮肤代谢物、皮肤微生物群之间的相关性，招募了 83 名健康的亚洲志愿者（年龄在21至60岁之间），并对他们的皮肤生理临床参数（例如 Tewameter 和皱纹）进行了表征。通过拭子采集皮肤代谢物，采用非靶向代谢组学技术进行分析，并利用高通量检测技术检测不同年龄段的皮肤微生物组。通过皮尔逊相关分析进行多组学研究。 PLS-DA 和Student-t 检验表明，几种关键代谢物（例如异柠檬酸）在老年组和年轻组中表现出显着差异。 KEGG通路分析发现，三羧酸（TCA）循环是最主要的代谢通路。此外，微生物组多样性随着年龄的增长而增加，丙酸杆菌和痤疮皮肤杆菌在物种水平上的差异表明了这一点。多组学数据跨领域相关性还表明临床皮肤参数、皮肤代谢物和皮肤微生物组是相互影响的。这项工作为研究皮肤衰老和皮肤屏障机制以及开发微生态相关化妆品提供更深入的见解。1.引言皮肤是人体最大的器官，是抵御外界环境有害刺激的第一道屏障[1]。随着人们年龄的增长，表皮的皮肤屏障功能逐渐遭到破坏，导致表皮变薄，皮肤含水量减少，出现皱纹、斑点等衰老迹象[2]。皮肤屏障的丧失可导致多种皮肤病，如特应性皮炎、玫瑰痤疮和湿疹等[3]。因此，弄清楚皮肤衰老的潜在生理机制对于寻找与衰老相关的皮肤功能障碍和皮肤疾病的新靶点和解决方案至关重要，这也有助于设计有效的抗衰老护肤产品。近几十年来，代谢组学已成为研究代谢物与生理病理变化之间关系的有力工具[4,5]。代谢组学通常涉及先进的分析化学技术（例如超高效液相色谱-质谱法，UHPLC-MS）和复杂的统计方法[6,7]。皮肤代谢物是存在于皮肤中的低分子量化合物（&lt;1500，例如小分子糖、有机酸、脂质和氨基酸），在屏障功能、水合作用、微生物入侵和免疫反应中发挥重要作用[8]。因此，研究皮肤衰老和皮肤屏障变化的潜在分子代谢机制具有重要意义。微生物是位于我们体内负责维持系统稳态的微生物[9]。目前，大多数研究都集中在肠道微生物组和肠道微生物组相互作用的机制上[10]。肠道微生物组的组成和丰度并不固定，在不同的生理条件下会有所不同[11]。最近，发现微生物组与许多皮肤病高度相关，例如特应性皮炎、痤疮和牛皮癣[12]。然而，皮肤微生物组对皮肤状况（例如皮肤老化和皮肤屏障功能）的影响仍然知之甚少。与肠道微生物组不同，皮肤微生物组更容易获得，因此，它可能提供一种直接而简单的方法来阐明皮肤微生物组相互作用的生物学。在这项研究中，我们对 83 名健康的中国受试者（年龄从21岁至60岁）进行了横断面研究，对临床参数、皮肤代谢物和皮肤微生物组进行多组学分析。首先表征皮肤生理临床参数，并通过非靶向代谢组学技术收集和分析皮肤代谢物。进行京都基因和基因组百科全书（KEGG）途径分析以研究代谢途径的改变。此外，利用高通量检测技术对不同群体的皮肤微生物组进行了表征。通过皮尔逊相关分析进行皮肤状况、皮肤代谢物和皮肤微生物组之间的多组学研究。该研究为研究皮肤衰老和皮肤屏障功能提供了更深入的见解，并为微生态相关化妆品的开发提供理论依据。2.材料和方法2.1.受试者招募和皮肤临床参数评估本研究共招募了83名健康志愿者。志愿者从前一天晚上开始就被要求不能洗脸和涂抹皮肤/化妆品。该研究的所有参与者都接受了皮肤临床参数的评估。简而言之，用Tewameter TM Nano（德国，CK）测量左脸颊的tewameter。在 Indentometer IDM 800 上测量松紧度。在 Corneometer CM825（德国，CK）上测试水合作用和 Corneo。使用 MPA580 评估弹性、R2 和 F4。使用 Visioline 650 或 VISIA 测量皱纹。2.2.样本收集 根据之前的报告收集参与者的皮肤代谢物和微生物组[13]。简而言之，用 50 mM Tris 缓冲液（1 mM EDTA [pH 8.0] 和 0.5% Tween-20）冲洗无菌拭子，并擦拭约 2×2cm2 的指定左侧皮肤区域至少 50 次，以最大限度地提高样品采集。然后将所得样品在 4℃ 下以 13,000 rpm 离心 10 分钟。收集上清液并保存于-80℃用于皮肤代谢物检测和分析，沉淀用于皮肤微生物基因测序。2.3.皮肤非靶向代谢组学概况评估 2.3.1样品制备 将 400 μL 获得的皮肤样品加入 0.6 mL 2-氯苯丙氨酸 (4 ppm) 甲醇 (-20 °C)，涡旋 30 秒 [14]。然后，将标本在 4℃、13500 rpm 下离心 10 分钟。随后，取各样品200μL上清液经0.22μm滤膜过滤，滤液加入检测瓶中。取每个样品的 20 μL 滤液并混合作为质量控制 (QC) 样品。这些 QC 样品用于监测这些池混合物的分析结果的偏差，并将其与分析仪器本身引起的误差进行比较。留下的滤液用于LC-MS检测。关于皮肤代谢组的检测分析和微生物组测序和分析过程太过专业和繁琐，就不再此赘述了，大家可以参考原文。3. 结果 3.1临床皮肤参数分析我们招募了83名健康的中国受试者（年龄21至60岁），根据不同年龄将受试者分为A组（年轻组，年龄&lt;=40）和B组（老年组，年龄&gt;40）。对所有参与者的皮肤临床参数进行测量和比较，结果如图1所示。可以明显看出，不同年龄组的皱纹、弹性、Tewameter、紧致度、水合度和R2有所不同。尤其是年轻组的皱纹较少，弹性、紧致度和水合作用较好，皮肤状况较好。3.2.皮肤代谢物分析 为了研究老年受试者皮肤代谢物的变化，首先进行 UHPLC-MS 并获得总代谢物。如图 2a 所示，PCA 显示年轻组和老年组之间代谢谱存在明显分离，表明代谢活动不同。图 2b 显示32种显着改变的皮肤代谢物，由PLS-DA （VIP&gt;1），Student t 检验（p &lt; 0.05）确定。这些皮肤代谢物包括多种有机酸、脂质和不饱和脂肪酸等。例如，三羧酸（TCA）循环的重要中间体异柠檬酸（isocitric acid），被发现是显着改变的皮肤代谢物之一。这一结果揭示了异柠檬酸在调节皮肤衰老方面的潜在作用，这与之前关于异柠檬酸在皮肤衰老过程中发生变化的报道一致[28]。众所周知，皮肤屏障功能与年龄高度相关[29]，因此，我们进一步对上述结果进行线性回归，以校正年龄效应。如图 3a 所示，发现 14 种皮肤代谢物（例如富马酸、壬二酸、肌氨酸、黄嘌呤和几种二肽）与 Tewameter 值相关。例如，图3b显示较高的甘氨酰脯氨酸对应于较低的Tewameter值（即，更好的皮肤屏障功能），而较高的4-甲基苯磺酸导致较高的Tewameter值（图3c），即，较差的皮肤屏障功能。总之，这些结果表明中国老年人和年轻人的皮肤代谢物含量不同，这表明皮肤代谢物的差异可能是皮肤衰老状态的良好预测指标。3.3. KEGG代谢途径分析为了揭示潜在的代谢途径改变，对显着改变的代谢物进行了 KEGG 途径分析。结果表明，TCA循环在差异代谢物的途径富集中排名最主要的代谢途径（图4a）。这一结果表明TCA循环与皮肤代谢活动高度相关，这与之前的报道一致，即TCA循环是可以为线粒体提供能量的重要代谢途径[30]。图4b显示了TCA循环中一个重要的限速步骤，即从异柠檬酸生产α-酮戊二酸(α-KG)。有趣的是，发现年轻组中异柠檬酸丰度较低（图4c），而异柠檬酸丰度较低的年轻组能够合成更多的α-酮戊二酸（α-KG）。这些结果表明，能够介导 TCA 循环的化妆品成分可能具有调节皮肤年龄和皮肤屏障功能的能力。3.4.皮肤微生物群分析为了研究老年人皮肤微生物群的变化，我们在物种水平（图5a）和基因水平（图5b）进行了统计分析和student t检验。 α多样性结果显示，老年组的Shannon指数、数量和均匀度均显着高于年轻组（p&lt;0.01）。此外，基因的Beta多样性结果清楚地表明，年轻组和老年组之间的皮肤微生物群具有良好的分离性，表明他们的皮肤微生物群存在差异。不同皮肤微生物群的平均相对丰度如图6所示。可以发现，老年组的皮肤微生物群丰度远高于年轻组，这与已发表的作品一致[31]。特别是，我们观察到一些微生物群（例如弗朗西斯菌、丙酸杆菌和痤疮皮肤杆菌Francisella, Propionibacterium,and Cutibacterium acnes）在年轻受试者中丰度较高（图 6）。正如许多先前的研究指出的那样，这三种微生物组与年轻人痤疮的形成高度相关[32]。此外，图6显示许多微生物组，包括微杆菌、放线菌和克罗彭斯特杆杆菌(microbacterium, actinomycetales bacterium, and aorynebacterium kroppenst)，在老年人中的丰度相对较高。综上所述，这些结果表明中国老年人和年轻人的皮肤微生物组不同，而皮肤微生物组的差异可能反过来调节皮肤状况（例如皮肤屏障功能）。3.5.多组学分析为了进一步研究皮肤临床参数、皮肤代谢物和皮肤微生物组之间的潜在关系，进行了多组学分析（结果如图7所示）。很明显，这些皮肤代谢物和皮肤微生物组在影响关键皮肤临床参数（即 Tewameter、皱纹、紧致度、水合作用、F4 和 R2）方面发挥着重要作用。例如，二甘氨酸、甘氨酰脯氨酸和两种二肽（His-Gly 和 Gly-His）对 Tewameter 具有负面影响，并导致更好的皮肤屏障功能。与此形成鲜明对比的是，黄嘌呤、富马酸、环腺苷二磷酸核糖对Tewameter表现出积极作用，导致皮肤屏障功能不佳。（备注：Tewameter是经皮水分流失，数值越高代表皮肤屏障功能越差）有趣的是，棕榈酰肉碱（Car（16:0）被发现与年轻人中丰富的两种微生物群痤疮角质杆菌和丙酸杆菌（Cutibacterium acnes and Propionibacterium）高度相关，揭示了皮肤代谢物与皮肤微生物群之间的密切关系。4 讨论 皮肤衰老是一个不可避免的生理过程，往往伴随着皮肤屏障功能受损而导致的干燥、弹性下降、皱纹的形成等[3]。经典衰老理论逐渐揭示了人体内与衰老相关的生化反应的作用，包括过量活性氧的产生、DNA突变、端粒缩短以及外界环境因素（如紫外线、空气污染等）的变化等。皮肤老化[33]。然而，利用代谢组学和微生物组研究皮肤衰老状况却很少受到关注。在本研究中，我们利用 UHPLC-MS 代谢组学方法和宏基因组测序对 83 名健康中国人的皮肤代谢物和皮肤微生物组进行了表征。在非靶向代谢组学研究中，我们发现与年轻人相比，老年人的许多皮肤代谢物（例如有机酸和肽）发生了显着变化。这些物质包括富马酸、壬二酸、肌氨酸和黄嘌呤，可能与皮肤屏障功能密切相关。此外，通路分析表明，TCA循环是差异代谢物通路富集中最主要的代谢通路之一。这意味着可以调节TCA循环的化妆品成分（例如含有α-KG的麦肤饮）可能具有控制皮肤老化和皮肤屏障功能的潜力[30]。先前的研究报道，老年人和年轻人的代谢组和肠道微生物组是不同的[34]。我们的宏基因组研究表明，中国老年人和年轻人的皮肤微生物组是不同的。与年轻组相比，老年组的皮肤微生物群丰度要高得多。例如，一些微生物组（例如弗朗西斯菌、丙酸杆菌和痤疮皮肤杆菌）在年轻受试者中具有较高的丰度，而许多微生物组（例如微生物）在老年受试者中表现出较高的丰度。此外，多组学分析（即皮肤参数、代谢物和微生物组）结果表明，皮肤代谢物和皮肤微生物组在关键皮肤临床参数（即Tewameter）中发挥着重要作用。特别是，发现几种皮肤代谢物（例如二甘氨酸和甘氨酰脯氨酸）和皮肤微生物组与皮肤老化和皮肤屏障功能高度相关。这些发现启发我们，一些可以影响皮肤代谢物和皮肤微生物组的化妆品成分可能是有效的抗衰老成分。这项研究也为深入了解皮肤老化和皮肤屏障机制提供了更深入的见解，有利于开发具有抗衰老功效的微生态相关化妆品。