text: 一株稻鱼共生菌株的筛选及发酵培养基优化
  稻鱼共育（RF）是一个小型生态系统，其中微生物广泛分布在鱼类、水环境、土壤和植物中。为了研究RF生态系统中微生物对鲤鱼和水稻的积极影响，从鲤鱼（Cyprinus carpio）的肠道内容物中筛选出18株具有促生长能力的菌株，其中3株既能产生DDP-IV抑制剂，又能产生IAA。结合能力最强的菌株FYN-22在生理、生化和16S rRNA上被鉴定，最初被鉴定为地衣芽孢杆菌。由于菌株在自然条件下分泌的代谢产物数量不足以生产，因此通过一次一因子（OFAT）实验和响应面法（RSM）对FYN-22发酵培养基配方进行了优化。结果表明，在可溶性淀粉浓度为10.961的条件下u2009g/l，酵母浓度为2.366u2009g/l，NH4Cl浓度为1.881u2009g/l，FeCl3浓度为0.850u2009g/l，发酵液中FYN-22孢子的实际测量数量为1.913u2009×u2009109u2009CFU/ml，比优化前的值提高了2.575倍。优化的发酵溶液用于水稻种子的浸渍操作，14u2009在水培箱中培养几天后，发现FYN-22菌株具有48.31%的高度显著增强（pu2009&lt;u20090.01），对根长、鲜重和干重的影响程度不同（分别为16.73、17.80和21.97%；pu2009&lt;u20090.05）。本研究可能为地衣芽孢杆菌FYN-22的发酵过程及其在RF系统中的进一步应用提供新的见解。介绍水稻单一种植的生产成本不断增加，以及对农民粮食安全的担忧，促使农民采用水稻-鱼类综合养殖（RF）（Arunrat和Sereenonchai，2022）。RF正被中国政府大规模推广，因为它能够节省大量的水和土地资源，促进可持续水产养殖，提高水稻产量，减少化肥的使用，同时也在一定程度上减少了贫困（Prein，2002；Frei和Becker，2005；罗，2018；袁等人，2022）。截至2020年，RF的农业面积高达9596u2009km2，鱼类产量高达85.69万吨，占中国RF养殖总面积的41.41%，鱼类总产量的29.41%，占据着非常重要的地位（农业农村部渔业司，2021；Arunrat等人，2022）。一些研究已经证明，在RF生态系统中适当的养鱼不仅不会降低水稻产量，反而会减少病虫害，此外还能控制杂草（Nico等人，2002；Vromant等人，2002年），从而减少除草剂和杀虫剂的使用（Barbara等人，2018），甚至提高种植的动植物的产量和质量（Jinzhao等人，2020）。此外，与传统的水稻种植或养鱼相比，RF中的水稻可以利用农场动物排泄和微生物固定中的含氮元素，减少外源氮的输入，加速氮的循环利用，从而减少肥料的使用（Jinfei et al.，2016）。微生物作为RF中养分循环的重要因子，一方面在养分循环、土壤肥力的形成和维持以及生态改善中发挥着重要作用（Insam et al.，1996）；另一方面，它们定植于鱼类的肠道，从而定植于固有的肠道菌群，形成一个肠道微生物与宿主及其生活的水生环境相互调节、相互依存的微生态系统（Zhang et al.，2014）。芽孢杆菌属是研究较多的植物促进内生细菌属之一。常见的芽孢杆菌主要有蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。研究发现，芽孢杆菌易于分离纯化，同时产生耐热和耐药杆菌，且该制剂稳定、抑制力强、易于应用、可运输，是一种重要的致病微生物（Yeong et al.，2020）。地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是一种孤雌生殖革兰氏阳性细菌，具有高度稳定性，以内孔的形式耐高温和酸性条件。地衣芽孢杆菌能分泌多种消化酶、生长因子和抗菌物质，能有效促进营养物质的降解，辅助身体的能量代谢，同时还能通过与有害细菌竞争定殖位点，促进有益细菌的定殖，可以在改善肠道健康方面发挥作用（Lu et al.，2020）。地衣芽孢杆菌促进植物生长的作用包括直接和间接机制。直接促生长作用主要是通过合成植物生长所需的化合物，如吲哚乙酸（IAA）、ACC脱氨酶、细胞分裂素（CTK）和赤霉素（GAs），或通过固氮以及磷和钾的去除，增加氮、磷、，以及可以在土壤环境中直接吸收的钾（春泉等人，2000；拉纳等人，2011年；Rais等人，2017）；间接促进作用是通过改善土壤微生物群落结构（Wang et al.，2019）。IAA作为一种植物生长调节剂，可以促进植物根系生长，增加根系长度和侧根生长数量，加快作物生长过程中土壤养分的吸收和转化效率（Teintze et al.，1981），并刺激植物分泌ACC脱氨酶（Kim et al.，2008）。由于菌株在自然条件下分泌的代谢物水平不足以生产，因此通过提高发酵液中地衣芽孢杆菌孢子的浓度间接提高了发酵液中代谢物的水平。众所周知，不同的地衣芽孢杆菌菌株需要特定的培养基才能实现最大的分生孢子产量；因此，我们通过数学建模优化了适合地衣芽孢杆菌（FYN-22）的发酵培养基配方。一次一因子（OFAT）实验代表了一种经典而有效的筛选方法，该方法允许对发酵培养基配方进行初步筛选并确定相应的浓度范围（Jawan等人，2021）。响应面法（RSM）是一种相对较新的统计方法，它允许将系统的响应值可视化为一个或多个因素的函数，并用图形表示测试结果（Zhilong et al.，2009）。RSM使用多元二次回归方程来拟合因子和响应值之间的函数关系，并且可以对回归方程进行分析以获得能够解决多变量问题的最优操作参数。OFAT和RSM都有其局限性，通过使用这两种方法的组合，可以弥补它们的缺点，以获得所需的实验结果（Venkatachalam等人，2019；Mulatu等人，2021；Willig等人，2022）。因此，本研究从RF培养的鲤鱼（Cyprinus carpio）肠道中筛选出FYN-22（地衣芽孢杆菌），并利用数学模型优化了FYN-22的培养条件。通过对LJ-31水稻幼苗的生长促进试验验证了优化菌株的效果，以评估该菌株在RF系统中的益生菌效果。材料和方法实验材料2021年9月，一群普通鲤鱼养殖了三条健康的一年生普通鲤鱼（150u2009±u200910u2009g） ，是从辽宁省盘锦市大洼区的一块稻田中随机选择的，在白浆水稻土（1.03u2009g/cm3容量，61.5%孔隙率，平均饱和含水量为0-30u2009cm体积为55.6%，pH为6.52）。用MS-222麻醉剂（250u2009毫克/升）。用无水乙醇擦拭鲤鱼表面，然后用消毒剪刀和钳子在超清洁的工作台上解剖。取出鲤鱼的整个肠道，将内容物轻轻挤出一个装有玻璃珠和50u2009ml无菌水，在180度下摇动之前u200930转/分u2009在室温下最小。随后用100进行梯度稀释u2009μl施加在LB固体介质板上的10−3、10−4和10−5梯度；每个梯度重复三次，并在28°C下孵育48小时u2009h.48小时后u2009培养h，选择不同形状的菌株进行分离。所有程序均经当地伦理委员会批准，并遵循欧洲动物实验指令2010/63/EU。IAA活性测定将来自鲤鱼肠道内容物的菌落分离株接种到含有L-色氨酸的R2A液体培养基中，并孵育4u2009在28°C的温度下，在180°C的恒定摇床上振荡几天u2009转速。然后，500u2009将μl细菌悬浮液移到2u2009ml玻璃瓶和500u2009μl的Salkowski比色溶液。IAA（500u2009mg/l）也加入到Salkowski比色溶液中作为阳性对照。2u2009ml玻璃瓶在室温下储存并避光30分钟u2009分钟后观察颜色变化。红色表示菌株在L-typtophan存在下产生IAA的能力。接下来，10u2009精确称量mg IAA并将其溶解在少量无水乙醇中，然后加入蒸馏水将体积固定为100u2009ml，从而构成浓度为100的IAA溶液u2009μg/ml作为储备溶液。然后将储备溶液稀释并配置成一系列浓度为0（空白）、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0和25.0的标准品u2009μg/ml作为工作溶液。然后，2u2009在加入两体积的Salkowski比色溶液之前，将ml上述工作溶液加入八个试管中。溶液在40°C下保温30u2009分钟，然后在530测量吸光度u2009纳米。以OD530为水平坐标，IAA浓度为垂直坐标绘制IAA标准曲线。在与初筛相同的培养条件下对菌株的IAA生产能力进行定量。530时悬架的外径值u2009nm进行分光光度测定；然后，将悬浮液在10000下离心u200910转/分u2009分钟，将上清液加入等体积的Salkowski比色溶液中并静置30u2009在40°C、避光条件下保持最小值，以显色并确定530时的OD值u2009纳米。计算每单位体积发酵液的IAA浓度，OD530值为1（较高浓度的细菌培养液需要适当稀释）（Chhetri等人，2022）。Screening and fermentation medium optimization of a strain favorable to Rice–fish Coculture