text: 糖基化是细胞外蛋白质组的基本特征，而表征糖蛋白一直以来都极富挑战性。科学家们在改进糖蛋白质组学分析方法领域付出了大量努力，并取得了显著的成果，明显提升了分析完整糖肽方面的能力，能够对糖蛋白进行位点特异性地表征，从而获取整个糖蛋白质组宏观和微观异质性方面的信息。这些成果在很大程度上归功于存在一致的 N-糖基化序列基序，N-糖基化位点所在的位置是经典蛋白酶可及的，有效的糖苷内切酶（如 PNGase F）等原因，现如今可以在一次实验中分析数以千计的 N-糖肽和 N-糖基化位点。与之相反，O-糖蛋白分析却没有这么多优势，不仅没有明确的蛋白共有序列去确定 O-糖基化位点，并且缺乏一种功能强大的酶，用来释放整个复杂的 O-糖链，这使得 O-糖基化的表征困难重重，更加富有挑战性。
  为了克服这些技术障碍，科学家们发明了一种用于 O-聚糖和 O-糖基化位点分析的新兴糖蛋白组学分析方法，方法的核心是使用细菌 O-聚糖特异性蛋白酶（O-糖肽酶或 O-糖蛋白酶）。O-糖蛋白酶是一组种类不断增加的高度特异性的酶，可识别并切割糖肽/糖蛋白上，与 O-糖基化丝氨酸或苏氨酸相邻的位置。对 O-糖蛋白酶酶切产生的糖肽进行 MS 分析，可提供有关蛋白序列中 O-糖基化位点和每个糖基化位点上连接的 O-糖链结构的重要信息。
  尽管在理解这类新兴 O-糖蛋白酶方面已经取得了重大进展，但很多已知的 O-糖蛋白酶仍然在应用方面存在一定的局限性。例如来源于 Akkermansia municiphila 的 O-糖蛋白酶 OgpA，和来源于 Bacteroides thetaiotaomicron 的 O-糖蛋白酶 BT4244 不能水解唾液酸化的糖肽，或水解能力有限。来自肠出血性大肠杆菌菌株的粘蛋白特异性蛋白酶 StcE，能够选择性地识别和切割高度糖基化的粘蛋白结构域，但对于轻度糖基化的O-糖蛋白没有活性。来自不动杆菌属（Acinetobacter）的糖蛋白酶 CpaA 的活性不受唾液酸存在的影响，但它仅识别前边为脯氨酸的 O-糖基化位点 (Pro-Ser/Thr)。来自肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的锌金属蛋白酶 C (ZmpC) 也不受唾液酸的影响，但会选择性地作用于粘蛋白，并在肽链上距离 O-糖基化位点几个氨基酸的位置切割。根据以上提到的问题，在分析实验流程中使用任何上述 O-糖蛋白酶，都可能会丢失有关 O-糖基化位点和/或存在于每个糖基化位点的 O-聚糖结构的宝贵信息，从而无法获得完整的 O-糖基化图谱。
  而另一种来源于铜绿假单胞菌的免疫调节金属蛋白酶 (IMPa) 可以很好地解决上述其它 O-糖蛋白酶遇到的难题，该酶在紧邻 O-糖基化丝氨酸或苏氨酸残基的 N 末端切割，可识别多种 O-连接聚糖结构，并且其活性不受聚糖上存在的唾液酸的影响。此外，这是一种具有广谱特异性的 O-糖蛋白酶，切割位点附近氨基酸对于活性的影响几乎可以忽略。
  来自 NEB 的科学家们比较了 IMPa 与其它几种曾经报道过可以特异性识别 O-聚糖的蛋白酶的特异性（表 1）。实验过程中，将三种荧光标记的 O-糖肽底物（分别为抗原、唾液酸化的 TF 抗原和 Tn 抗原）与重组表达并纯化的 O-糖蛋白酶共孵育，使用毛细管电泳分析反应产物。实验结果发现，只有 IMPa 能够高效地切割三种含有不同类型 O-连接糖链的糖肽（97-99% 的切割效率），而其它几种测试的 O-糖蛋白酶表现出不同程度的切割效率。来自拟杆菌属（Bacteroides）的 BT4244 能够切割含有 TF 和 Tn 抗原的糖肽，但对具有唾液酸化 TF 抗原的肽没有活性，而来自 Akkermansia 的 OgpA 有效地酶切了带有非唾液酸化 TF 抗原的多肽，但对带有唾液酸化 TF 抗原的糖肽几乎没有活性，对含有 Tn 抗原的糖肽没有活性。未检测到 StcE 对粘蛋白型糖肽（所有三种类型底物）的活性。此外，这些蛋白酶对缺乏 O-聚糖的对照肽均无活性，说明在实验中观察到的 IMPa、BT4244 和 OgpA 活性取决于 O-聚糖的存在。由此可见，IMPa 在对 O-连接糖链识别和切割方面的能力要远远优于其它几种 O-糖蛋白酶。
  表 1：几种已知的 O-糖蛋白酶对 FAM 标记的糖肽底物的活性
  后来由斯坦福教授 Nicholas M. Riley 等人发表在 Molecular Omics 上的一篇文章中，使用O-Pair Search 分析方法进一步证明了 IMPa O-糖蛋白酶在分析鉴定 O-聚糖方面的能力优于 OgpA 和 StcE（如下图）。
  目前 IMPa O-糖蛋白酶已经由 NEB 商业化为产品 O-糖蛋白酶（IMPa）（NEB #P0761），以下为该产品的详细介绍
  O-糖蛋白酶（IMPa），也称为免疫调节蛋白酶 (IMPa)，是一种来自铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），具有广谱特异性的 O-糖蛋白酶。它识别糖蛋白或糖肽中的粘蛋白型 O-连接糖链，包括含支链和唾液酸化结构的糖链，切割位置为紧邻糖基化丝氨酸或苏氨酸残基的 N 端肽键上。它可用于在糖蛋白组学实验流程中，测定 O-糖基化位点图谱，并对每个糖基化位点上存在的 O-糖链进行结构分析。O-糖蛋白酶含有 6 × His-tag，使用镍亲和树脂可轻松从反应体系中去除。
  Vainauskas S. et al. Anal. Chem.. 2021, 94(2): 1060-1069.
  Riley N M. et al.. Mol. Omics.. 2022, 18(10): 908-922.
  Malaker S A. et al. Proc. Nat. Acad. Sci.. 2019, 116(15): 7278-7287.