text: 间充质干细胞通过隧道纳米管转运线粒体减轻内皮细胞缺血损伤并改善大鼠缺血性卒中预后的研究--《山东大学》2014年博士论文
  在缺血性脑血管疾病中,血管内皮的损伤是主要的起病始动因素;而血管的修复,尤其是缺血半暗区受损血管的修复,又是挽救缺血受损神经元的前提;同时脑微血管内皮细胞的损伤是也导致血脑屏障开放、脑水肿发生,从而加重神经元细胞损伤的重要因素。
  因此,针对移植的间充质干细胞与缺血再灌注损伤的微血管及内皮细胞之间的相互作用需要进一步的研究。
  在缺血再灌注损伤的复杂机制中,线粒体损伤是其中的关键环节。
  线粒体在有氧代谢、氧化磷酸化和细胞凋亡等多种病理生理过程中发挥着关键作用。
  目前,一种新型通讯连接方式的发现正在引发人们对细胞通讯认识的革命:最近在动物细胞间发现了一种细长膜管状细胞连接一隧道纳米管((tunneling nanotubes, TNTs)。
  TNTs的发现揭示了一种全新的细胞间交流通道,引发了人们对细胞相互作用方式的重新思考,直到目前其研究仍处于初步阶段,许多问题还有待于进一步解决。
  第一部分间充质干细胞通过隧道纳米管转运线粒体保护类缺血n损伤的内皮细胞的研究
  2、探究影响TNTs形成的因素并揭示TNTs的形成机制。
  3、探讨线粒体能否通过TNTs在两种细胞间进行有效的转运。
  4、探讨干细胞能否通过建立TNTs转运线粒体以保护类缺血损伤的内皮细胞。
  密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,经培养扩增后,流式细胞术鉴定间充质干细胞表型为CD29、CD44和CD105阳性, CD34和CD45阴性。
  2、对比分析正常条件下骨髓间充质干细胞与脐静脉内皮细胞的线粒体功能。
  通过生物能量代谢监测仪分析细胞的耗氧率(oxygen consumption rate, OCR)和产酸率(extracellular acidification rate, ECAR),经细胞计数校正后的耗氧率和产酸率数值可直接反映出MSCs和HUVECs的线粒体功能差异。
  3、建立干细胞与类缺血损伤后内皮细胞的共培养模型。
  在缺氧培养箱中对HUVECs实施氧糖剥夺处理150分钟,再将处理的细胞进行复氧复糖处理,4小时后将等量的间充质干细胞与之直接混合培养,以建立干细胞与类缺血损伤后内皮细胞的共培养模型。
  4、激光共聚焦显微镜观察隧道纳米管的形成及线粒体在其中的转运。
  应用激光共聚焦显微镜观察共培养的MSCs和HUVECs之间隧道纳米管的形成以及线粒体在其中的转运情况,并对不同干预条件下的两种细胞间形成的TNT及膜突起(membrane protrusions, MPs)计数统计。
  5、应用流式细胞术分选并定量分析混合培养后两种细胞间线粒体的相互转移率。
  利用Hoechst33342标记的间充质干细胞细胞核,以及干细胞和内皮细胞两种细胞间的形态差异,采用流式细胞分选术将共培养48小时后的两种细胞分选开来。
  6、分析间充质干细胞对共培养脐静脉内皮细胞的有氧代谢、细胞活性及凋亡率的影响;并检测丝状肌动蛋白(filamentous actin, F-actin)解聚剂latrunculin-A (LatA)、磷脂酰丝氨酸位点阻断剂Annexin V和线粒体功能缺失的干细胞对其共培养效应的影响。
  采用流式细胞分选术将不同的共培养组中的脐静脉内皮细胞分离出来。
  7、分析干细胞的旁分泌功能和细胞融合等因素对内皮细胞活性的影响。
  收集浓缩不同处理条件下的间充质干细胞条件培养液,应用ELISA试剂盒检查其中的血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor BB, PDGF-BB)和成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor2,FGF-2)的含量,以明确干细胞的旁分泌功能对内皮细胞活性的影响。
  采用直接测序法对比检测共培养前后的HUVECs和MSCs的线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA),明确共培养后被MSCs营救的HUVECs是否含有来源于MSCs的线粒体。
  将染色标记好的血小板和干细胞线粒体加入缺血受损的内皮细胞中直接共培养,激光共聚焦显微镜观察共培养48小时后的内皮细胞的生存状况,从而分析内皮细胞是否主动吞噬了细胞外游离的线粒体。
  2、激光共聚焦显微镜证实共培养的间充质干细胞与脐静脉内皮细胞间可建立隧道纳米管结构联系,线粒体可在其中进行双向转运(两种细胞间的双向转移率大致均衡)。
  3、激光共聚焦显微镜证实类缺血再灌注损伤能介导脐静脉内皮细胞与间充质干细胞间建立更为复杂和广泛的网络状TNT联系,并促使TNT中的线粒体双向交换变为单向转运(由干细胞向内皮细胞方向),且(流式细胞术证实)其转移率显著提高。
  4、LatA和Annexin V可显著减少脐静脉内皮细胞与间充质干细胞间的TNTs数量,表明TNTs的形成是依赖F-actin的聚合和磷脂酰丝氨酸的外化的过程。
  5、间充质干细胞通过隧道纳米管将自身线粒体转运至类缺血再灌注损伤的脐静脉内皮细胞内,以修复其有氧代谢功能并减少细胞凋亡。
  F-actin解聚剂LatA、磷脂酰丝氨酸位点阻断剂Annexin V均可显著抑制该保护效应(p0.05)。
  6、LatA和Annexin V的处理对间充质干细胞的旁分泌促血管新生作用细胞因子(VEGF, PDGF-BB, FGF-2)的功能没有显著影响,因此间充质干细胞的旁分泌功能不是其保护内皮细胞的关键机制。
  第二部分间充质干细胞保护大鼠脑微血管系统线粒体的功能并改善缺血性卒中预后的研究
  2、探讨间充质干细胞移植对脑梗死大鼠运动神经功能恢复的影响。
  3、研究间充质干细胞对脑梗死大鼠缺血脑组织血管新生的影响。
  4、探讨间充质干细胞移植对缺血受损脑微血管的线粒体功能的影响。
  5、进一步探讨隧道纳米管介导的线粒体转移机制在干细胞改善脑梗死大鼠预后中的作用。
  线栓法制备大鼠的大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)后再灌注模型。
  术后对大鼠进行神经功能缺损评分,并根据评分结果选取大鼠进人下一步实验
  对大鼠的间充质干细胞进行分离、培养和鉴定。
  间充质干细胞移植术7天后,采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)对不同处理组大鼠梗死后的脑组织进行染色,应用ImageJ软件进一步分析梗死体积。
  4、测试脑梗死大鼠的运动神经功能。
  应用转棒疲劳实验和跑轮实验对MCAO术前及MSCs移植术后的第1、7、14和28天的大鼠进行测试,以评估间充质干细胞移植及其它不同处理因素对脑梗死大鼠的运动神经功能恢复的影响。
  5、探讨脑微血管的密度与接受移植干细胞线粒体的宿主细胞数量间的关系。
  受试大鼠接受动脉注射的绿色荧光染料(fluorescein isothiocyanate-dextran amine, FD-2000S)以达到激光共聚焦显微镜下脑微血管充分显影的效果。
  6、分离纯化脑微血管片段,并检测其线粒体功能。
  取梗死侧的大脑半球,采用两次酶消化法和密度梯度离心法分离和纯化脑微血管片段。
  5、LatA和Annexin V并不影响缺血半暗区内DsRed2+/Hoechst33342+细胞的数量(DsRed2+/Hoechst33342+细胞即为示踪出的植入术后全部的MSCs,包括了可能发生细胞融合和转分化的MSCs),证实LatA和Annexin V对干细胞的归巢、滞留和迁移没有造成显著影响。
  2、类缺血再灌注损伤能介导内皮细胞与间充质干细胞间建立更为广泛和复杂的TNTs联系网络,并促使TNTs介导的线粒体双向均等交换转变为从干细胞向内皮细胞方向的单向转运,其转移率也显著提高。
  3、TNTs的形成可能反映了细胞在应激或损伤状态下表现出的一种自我防御和营救机制。
  4、体内实验进一步证实:间充质干细胞通过隧道纳米管转运线粒体可能是其保护缺血受损脑微血管的线粒体功能、促进血管新生并改善卒中大鼠的预后的关键机制。