text: 分析方法验证的统计学评价：准确度与精密度
  在新药申报资料中，药品质量控制部分（3.2.S.4和3.2.P.5）包括质量标准、放行检测数据、分析方法、分析方法验证和质量标准接受限度的说明，其中分析方法验证是最基本的组成要素，它影响着分析数据的可靠性和一致性。分析方法验证需要进行的检测项目和验证指标，ICH Q2(R1)、 ChP2020 &lt;9101&gt; 分析方法验证指导原则和 USP&lt;1225&gt;分析方法验证通则都有明确的规定，如ChP2020&lt;9101&gt;分析方法验证指导原则中规定根据检验项目的不同，视具体情况列出了验证的指标，如专属性、准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。专属性指在其他成分，如杂质、降解产物、辅料等可能存在下，采用的分析方法能正确测试被检测物的能力。含量和杂质测定方法均应考察其专属性。色谱方法专属性统计指标常用分离度来表示，是由相邻两峰的保留时间和峰宽计算得到。一般情况分离度应不小于1.5。对于已知杂质峰，在方法验证时需要进行对照品的保留时间定性。对于未知的杂质峰，常用相对保留时间进行定性表示。分析方法验证中最重要的两个参数准确度和精密度在常规的官方指南有接受标准，常依据验证水平来选择和确定接受标准，本文试图展开叙述与讨论准确度和精密度常见的统计指标和统计学评价方法。一、准确度准确度系指用所建立的分析方法测定的结果与真实值或参比值接近的程度。通常通过加入已知量的对照品计算回收率，或对已知浓度标准品的测试结果与理论值计算误差。一般实验平行测定6份相同浓度，或由高、中、低各3份共9份样品。分析测试数据属于一种概率性数据，存在着不确定度。它表示测试值存在与真值之间存在误差。真值是理论值，测量值能否被接受的程度为不确定度。测量中的误差包括随机误差和系统误差。随机误差受实验室温度、湿度、电压仪器性能等偶然因素引起，方向通常不固定。系统误差受某种特定系统原因造成，如方法、仪器和人员操作，一般有固定的方向。准确度表示了方法的系统误差。1. 回收率：测得结果与真实值之间的比值：2.回收率均值:3.回收率标准差：4 回收率相对标准差：二.、精密度精密度是指在规定条件下，同一份均匀样品，经多次取样测定的结果之间的接近程度。包括重复性、中间精密度和复现性。重复性指同一个分析人员测得的精密度；中间精密度：在同一个实验室内改变条件，不同分析人员、不同设备等测定结果之间的精密度；重现性：不同实验室之间的测试结果精密度。精密度表示方法的随机误差，一般用偏差、相对偏差、标准偏差或相对标准偏差来表示。1.偏差（Deviation）：指各个测定值与测定的平均值之差。用于衡量测定结果的精密度高低2.相对偏差（Relative deviation, RD）：指某一次测量的绝对偏差占平增多值的百分比。用于衡量单项结果对平均值的偏离程度。标准偏差和相对标准偏差的计算原理同上述准确度部分一致。重复性精密度的接收标准：RSD%:NMT C-0.1505%粗放性和中间精密度的接收标准：RSD% :2C-0.1505%三、准确度与精密度的统计学评价a. 准确度与精密度的概率统计评价1) 在含量方法准确度考察中，平均回收率一般应在98.0% ~ 102.0%范围，三种浓度九份样品回收率数据的RSD应不大于2.0%。含量方法验证通过含量精密度与准确度的恰当结合，应用统计t分布概率来判定准确度结果是否在可接收标准范围。概率的接收标准为不小于0.95.概率结果 = t(qU,df)- t(qL,df)t(q,df)：df自由度在分位数q处的累积t分布；自由度df：n-1;Upper ： 接受标准的上限 (e.g., 102%为默认值)Mean：准确度值SD：标准偏差n：样品溶液数Lower ：接受标准的下限 (e.g., 98%为默认值)2) 杂质方法准确度在分析浓度线性范围内采用加样回收率研究。评估的范围一般为限度水平的50%-150%。接收标准如下：上面的计算公式来源于Horwitz方程，不同水平含量及对应的可接受变异度（RSD）如下图。图1. Horwitz方程重复性和回收率变异度接收标准b. 准确度与精密度置信区间评价样品分析测试结果可以表示用下面等式模型表示：Y = t + b + EY：报告值t：真实或可按受的标准值b：方法系统误差E：方法随机误差对于一个可靠的分析方法，一般来说t和b是固定的值。E值是一个均值为零、标准差为σ（sigma）且符合正态分布的随机变量。分析方法的准确度表示了报告值(Y)与真值(t)之间的一致性。它们之间的接近程度表示为（Y-t）的平均值，即系统误差b。USP&lt;1225&gt;通则提及用标准品或者另一个良好的正交方法得到的真值（t）进行赋值。准确度的建立应在分析方法的要求范围内。例1: 原料药使用某HPLC分析方法检测含量，使用有真值的对照品。测试了三种原料药浓度50%，100%，150%，每个浓度水平三份样品，结果如下表1.表1:含量测试结果表1的数据应用于统计学t分布进行评价，需要满足下面前提假设：i. 9份测试数据是相互独立的；ii. 各测试浓度水平的标准偏差是固定的；iii. 各测试浓度水平的平均值是相等的。基于上面假设等到统计量，b = `Y - t，b为系统误差，`Y为样品均值，t为对照品的真值。Y=Yi为各测量值，n为测试结果的数量。标准差统计量为，S为样本标准差，Yi为各测量值，n为测试结果的数量。系统误差存在不确定度，因此使用置信区间来表示它的不确定度。b的双侧置信区间100(1-2a)为：，等式1；b为双侧置信区间100(1-2a)的系统误差，为t分布的百分位数，左侧区域为1−a，自由度为（n−1）。如果a = 0.05, n = 9, ，得到一个双侧置信区间90%的系统误差b。表1中对照品真值t取1000 mg/g。b的置信区间为 = (992.81-1000) = [-9.94,-4.44]mg/g等式1中的双侧置信区间可以用于统计等效性的双侧检验。假设本方法是经过良好验证，系统误差的接受标准b 15m/g。经计算表1数据得到的区间[-9.94,-4.44]mg/g在15mg/g的范围内，可以认为方法的系统误差是可以接受的。对于标准差σ，通常需要表明标准差不要太大，因此只需要关注100(1−a)%的置信上限，σ的置信上限为：，等式2;U: σ的100(1−a)%上限区间；S：样本标准差；n：样本数中心卡方分布的百分位数，面积a区左侧区，自由度为n−1。等式2可以用于评估分析方法精密度。如果a=0.05, n=9, 得到,根据等式2,  = 4.44假设分析方法验证接受标准精密度要求&lt;20 mg/g，根据等式2计算得到的标准差7.60 mg/g &lt; 20 mg/g，因此可以认为方法的精密度在置信区间95%是良好的。c. 准确度的标准品评价标准品的认定值一般是通过多个具有较高测试水平的实验室，采用可靠分析方法进行协同实验，经数理统计方法确定的，可认为是基本消除了系统误差的参照值。一般认为法定标准物质具有上面的属性，如USP标准品，EP标准品。因此采用标准品检查分析方法的准确度是最简单和直接方法。统计学方法一般用t检验，对于检测值与标准品的认定值进行比较。使用待检查方法多次测试标准品，根据测量结果计算t检验统计量。测量值与认定值比较，需同时考虑认定值的标准不确定度uCRM, ，SCRM为认定值标准差，N为认定值数据组数。因此统计量计算得到。是测量结果平均值；S是单次测量的标准差；n为测量次数；u0是标准品认定值。统计量t与相应显著性水平的t分布临界值比较，自由度v = n + N – 2, 当统计量，表明测试结果与标准物质认定值不存在显著差异，方法的测定结果是准确的。四、结束语本文讨论了方法验证中的精密度和准确度的一些常见统计学指标及统计学评价方法。分析测量不确定度与分析方法密切相关的，精密度和准确度分别用来表征分析方法的随机误差和系统误差，进一步的置信区间和统计学评价在业界会越来越普遍和重视。参考文献1. USP PF39(5) &lt;1200&gt;: Requirements for Compendial Validation2. USP &lt;1210&gt;: Statistical Tools for Procedure Validation3. USP &lt;1225&gt; Validation of Compendial Procedures4. 中国药典2020&lt;9101&gt;：分析方法验证指导原则5. USP &lt;1010&gt;: Analytical Data - Interpretation and Treatment6. 药物杂质分析，胡昌勤，20157. 分析测试统计方法和质量控制，曹宏燕转载自：文亮频道