text: Glypican3相关miRNAs在人肝细胞癌变过程中的作用机制
  : 【研究背景】肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)起病隐匿,进展快,死亡率高,因此早期诊断对于提高患者的存活率至关重要。
  从病理学角度讲,HCC的发生是一个多阶段、多步骤逐步演变和积累的过程,其中一个最主要的过程就是从癌前病变进展为HCC。
  目前已经提出的癌前病变有:异型增生病灶(dysplastic foci,DF)、变异肝细胞结节(nodules of altered hepatocyte,NAH)和异型增生结节(dysplastic nodules,DN)。
  研究表明,很多高频出现于肝硬化、癌前病变以及小肝癌中的分子变异都可能是HCC的早期分子事件,对于这些早期分子变异的研究将有助于HCC的早期诊断并制定新的治疗策略。
  微小RNA(microRNA)(以下简称miRNA)是一类长约17-25个核苷酸的内源性非编码小RNA分子,在肿瘤发生不同阶段的水平存在显著差异。
  它的突变和异常表达与各种肿瘤发生发展相关,并且通过与靶信使RNA(messenger RNA,mRNA)的3’-非翻译区(untranslated region,UTR)不完全配对结合调控其靶基因的表达,从而发挥癌基因或抑癌基因的作用,与细胞的癌变也有着极为密切的关系。
  此外,mirnas能够抵抗内源性rna酶的降解从而在血浆中稳定存在,方便检测,且对患者无创伤性。
  关于mirnas与hcc的研究,文献中报道比较多,并且筛选出了一些与hcc发生发展、侵袭转移及预后等相关的、具有重要意义的mirnas。
  然而关于小肝癌、癌前病变以及癌前病变进展为hcc相关的mirnas表达变化,文献报道却颇为少见,而且仅限于动物模型。
  根据文献中已有的hccmirnas表达谱芯片数据筛选和查阅相关文献,我们发现mir-202、mir-1271-5p、mir-1271-3p和mir-204在hcc中表达水平下调,但在hcc中的表达变化及功能却未进一步深入研究。
  mir-211是mir-204的同源mirna,在其他一些恶性肿瘤中呈低表达,在hcc中的研究却未见报道。
  此外,mirnas是通过调控其下游的靶基因而发挥相应的生物学功能,寻找并鉴定mirnas调控的靶基因才可能阐明mirnas的作用机制。
  所以我们利用生物信息学方法及相关软件进行搜索和比对,结果发现了一个这五个mirnas可能共同调控的靶基因磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3,gpc3)。
  gpc3属于硫酸乙酰肝素糖蛋白家族,通过磷脂酰肌醇锚定在细胞膜表面,在细胞的生长发育和恶变过程中起到关键作用,是近年来研究的一个热点基因。
  有研究显示,gpc3及其mrna在hcc组织中高表达,并可能通过经典wnt信号通路发挥作用。
  而且,在hcc患者的血清中也可检测到gpc3,而在正常肝组织未检测到。
  因此认为其可作为一种新的非常有前景的hcc早期诊断的标志物。
  另外,有研究显示,gpc3在一些癌前病变中也有不同程度表达,提示其具有某种预警价值。
  肝硬化或dn恶性转化为hcc其特点为gpc3的表达明显增强,肝硬化组织中的小灶性病变如出现gpc3阳性则强烈提示为hcc,而不管阳性细胞的百分比。
  而且,我们之前的affymetrix单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,snp)6.0芯片结果也显示,gpc3在hcc中呈扩增状态。
  以上这些观点使我们从中受到启发,hcc中mir-202、mir-1271-5p、mir-1271-3p、mir-204低表达和mir-211可能低表达与它们可能共同的靶基因gpc3高表达这一现象以及gpc3通过wnt信号通路促进hcc发生这一机制,提示这5个mirnas与gpc3之间可能存在着某种联系,进一步探讨它们在hcc及其癌前病变中的表达以及与gpc3的靶向关系,阐明它们在肝细胞癌变过程中的作用机制,并找到用来干预的分子信号通路,可能更有助于hcc的监测、早期诊断和早期治疗。
  【目的】1.检测5个mirnas,即mir-202、mir-1271-5p、mir-1271-3p、mir-204和mir-211在肝癌细胞系和进展期hcc组织中的表达以及mir-202和mir-211对肝癌细胞生物性状的影响,进一步证实它们抑癌基因的作用;2.通过免疫组化法、克隆性分析及染色体杂合性缺失(lossofheterozygosity,loh)分析筛选出gpc3阳性且伴有分子畸变的dn(以下简称gpc3阳性dn),然后观察gpc3在gpc3阳性dn、小hcc和进展期hcc中的表达变化,证实gpc3在肝细胞癌变过程中发挥重要作用;3.检测mir-202和mir-211在gpc3阳性dn、小hcc和进展期hcc中的表达变化,阐明它们在肝细胞癌变过程中扮演的角色;4.证实mir-202和gpc3的负性转录后调控关系,阐明mir-202在hcc中可能的作用机制,为今后利用这些潜在的分子标志物进行hcc的监测、早期诊断以及选择合适的靶点进行干预和治疗提供新的理论依据。
  【方法】1.利用实时荧光定量多聚酶链反应(realtimequantitativepolymerasechainreaction,rt-qpcr)法检测5个mirnas在人肝癌细胞系和进展期hcc组织中的表达水平:1)检测5个mirnas在人肝癌细胞系hepg2、huh7和人正常肝细胞系hl-7702中的表达水平;2)检测5个mirnas在56例配对进展期hcc组织及相应非肿瘤肝组织中的表达水平;2.通过体外实验观察mir-202和mir-211对肝癌细胞生物学性状的影响,体内实验进一步探讨mir-202对肝癌细胞裸鼠致瘤的影响:1)根据56例配对进展期hcc的rt-qpcr检测结果,选择出相比非肿瘤肝组织在进展期hcc中有显著下调,且平均差异倍数下调2倍以上的mir-202和mir-211分别进行过表达,即将人工合成的mir-202mimic和mir-211mimic分别转染huh7细胞系,观察它们对肝癌细胞的增殖[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-h-tetrazoliumbromide,mtt法)、迁移(transwell实验)、侵袭(matrigel实验)以及细胞周期和凋亡(流式细胞术)的影响;2)裸鼠腋部皮下成瘤两周后,开始瘤内点状注射microntmagomir-202及其阴性对照(negativecontrol,nc),每三天注射一次,同时测量肿瘤体积,共持续两周,以观察其对肝癌细胞裸鼠致瘤的影响。
  3.检测可能的靶基因gpc3在肝癌细胞系、进展期hcc、小hcc及dn中的表达情况:1)免疫组化法观察gpc3在hcc及dn中的表达,克隆性分析技术及染色体loh检测进一步筛选出gpc3阳性dn:①利用maxvision免疫组织化学染色方法检测gpc3在136例hcc和103个dn中的表达情况,观察gpc3蛋白表达水平与hcc患者临床病理特征参数的关系;②利用x染色体失活的嵌合性及雄激素受体(androgenreceptor,ar)基因多态性的克隆性分析技术检测来自于女性81个dn的克隆性;③利用微卫星多态性位点及pcr技术检测103个dn在d8s262、d11s1301和d6s1008等11个微卫星多态性位点的染色体loh发生情况,然后挑选出女性患者中单克隆增生且gpc3阳性dn和男性患者中具有高频率染色体loh的gpc3阳性dn;2)利用rt-qpcr法检测gpc3mrna在肝癌细胞系、进展期hcc、小hcc和gpc3阳性dn中的表达情况及变化;4.rt-qpcr法检测mir-202和mir-211在10例小hcc和8例gpc3阳性dn中的表达水平,并与之前它们在进展期hcc中的表达水平相比较,筛选出可能参与肝细胞癌变的mir-202;5.mir-202与gpc3靶向关系的研究:1)转染mir-202mimic到肝癌细胞系huh7,培养48小时后,分别利用rt-qpcr和westernblotting检测gpc3mrna水平和蛋白表达情况;2)双荧光素酶报告实验验证mir-202与gpc3之间的负性调控关系。
  【结果】1.gpc3相关5个mirnas在肝癌细胞系和进展期hcc组织中的表达水平均显著下调:1)与正常肝细胞系hl-7702相比,mir-202、mir-1271-5p、mir-1271-3p、mir-204和mir-211在肝癌细胞系hepg2和huh7中的表达水平均显著下调,其中,在huh7比hepg2中下调更明显;2)相比非肿瘤肝组织,mir-202(p=0.002)、mir-1271-5p(p=0.002)、mir-1271-3p(p=0.018)、mir-204(p=0.029)和mir-211(p=0.000)在进展期hcc组织中表达水平均显著下调。
  其中,mir-202和mir-211表达水平下调平均差异倍数在2倍以上,但二者表达水平与hcc患者临床病理特征参数均不具有相关性;2.细胞功能实验显示过表达mir-202和mir-211后,肝癌细胞的增殖能力,集落形成能力、侵袭和迁移能力均明显减弱,但对细胞周期影响不明显。
  mir-202过表达后促进细胞凋亡,mir-211则对细胞凋亡影响不明显;体内试验显示裸鼠成瘤后每三天瘤内注射microntmagomir-202,相比对照组,肿瘤生长速度明显变慢,体积较小。
  3.gpc3在肝癌细胞系、进展期hcc、小hcc和dn中的表达水平均显著上调:1)maxvision免疫组织化学法检测结果表明,136例hcc中,103例表达gpc3(75.7%,103/136),且阳性率与乙型肝炎表面抗原(hepatitisbsurfaceantigen,hbsag)阳性相关(p=0.000);103个dn中,19例表达gpc3,阳性率为18.4%(19/103),其中包括16个高级别异型增生结节(high-gradedysplasticnodules,hgdn)和3个低级别异型增生结节(low-gradedysplasticnodules,lgdn);克隆性分析检测结果表明,来自于女性的15个gpc3阳性dn和28个gpc3阴性dn均是单克隆增生,即为肿瘤性增生;染色体loh检测则表明,gpc3阳性dn相比其阴性dn,hgdn相比lgdn,染色体loh发生频率均偏高。
  并根据以上三个步骤筛选出了19个gpc3阳性dn作为进一步研究对象;2)gpc3mrna在hepg2和huh7中的表达水平相比正常肝细胞系hl-7702均显著上调,其中在hepg2中的表达水平上调更显著;3)gpc3mrna在gpc3阳性dn、小hcc和进展期hcc中的表达水平依次上调,其中在小hcc中的相对表达水平较gpc3阳性dn差异显著(p=0.003),而与进展期hcc比较无显著差异(p=0.145);4.mir-202和mir-211在小hcc和gpc3阳性dn中的相对表达水平均显著下调。
  与之前它们在进展期hcc中的表达水平相比较,mir-202在gpc3阳性dn、小hcc和进展期hcc中的表达水平依次下调,且在gpc3阳性dn和小hcc中的表达水平具有显著差异(p=0.038),而小hcc与进展期hcc之间表达水平无显著差异(p=0.432)。
  mir-211在三者之间的表达水平则均无明显差异;5.mir-202与gpc3具有直接靶向负性转录后调控关系:1)在huh7细胞中过表达mir-202后,gpc3mrna及其蛋白表达水平均显著下调;2)双萤光素酶报告实验检测结果表明,分别共转染mir-202mimic(或mir-202mimicnc)和野生型或突变型gpc3-pmir-rb-reporttmvector后,野生型表达质粒其萤光素酶活性明显降低,而对含突变位点的mir-202表达质粒其萤光素酶活性无明显改变。
  【结论】1.GPC3相关miRNAs,即miR-202、mi R-1271-5p、mi R-1271-3p、miR-204和miR-211在HCC中的表达水平均显著下调,其中miR-202在GPC3阳性DN、小HCC和进展期HCC中的相对表达水平依次下调,且在GPC3阳性DN和小HCC中的表达水平具有显著差异,提示可能与肝细胞癌变有关,是HCC发生的早期分子事件,可作为HCC监测和早期诊断的潜在分子标志物。
  miR-211在HCC中呈低表达为首次发现。
  2.细胞功能实验显示,过表达miR-202和miR-211后,肝癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力均明显减弱,而对细胞周期无明显影响。
  miR-202过表达后促进细胞凋亡,miR-211过表达后则对细胞凋亡影响不明显。
  体内实验则表明,micrONTMagomir-202可显著抑制HCC的生长。
  以上这些结果均提示二者发挥抑癌基因的作用。
  3.GPC3在GPC3阳性DN,小HCC和进展期HCC中的表达水平依次上调,其中在小HCC中的相对表达水平较GPC3阳性DN差异显著,而与进展期HCC无显著差异,提示GPC3在肝细胞癌变过程中同样发挥重要作用;4.miR-202与GPC3具有直接负性转录后调控关系,并且可能通过下调GPC3表达经Wnt信号通路抑制肝癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡,从而抑制HCC发生。