text: 【对症创药】“万能钥匙”mRNA——HSV疫苗解法新思路 
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  单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）是疱疹病毒的典型代表，由于感染急性期发生水疱性皮炎即单纯疱疹而得名。单纯疱疹病毒能引起人类多种疾病，如龈口炎（gingivostomatitis）、角膜结膜炎（keratoconjunctivitis）、脑炎（encephalitis）以及生殖系统感染和新生儿的感染等。当初次感染后多会转为潜伏感染，受外界刺激后可引起复发。严重时如HSV-1和HSV-2可能分别导致唇癌、外阴癌及子宫颈癌的产生。单纯疱疹病毒可通过给新生儿注射疫苗来进行防治。2022年2月18号，Moderna公司便发布消息称他们正在启动3个新项目来拓展自己的mRNA管线。此次消息中公开的3款候选疫苗分别是：单纯疱疹病毒（HSV）mRNA疫苗，水痘-带状疱疹病毒（VSV），新免疫检查点癌症疫苗。
  图1 Moderna公司3款潜伏病毒mRNA疫苗研发管线
  许多读者可能会好奇，当公司在设计一款mRNA疫苗时应该考虑哪些方面的因素呢？就此问题，菌菌请教了一些疫苗研发方面的同学，他们给出了一些自己的见解:
  首先在设计mRNA疫苗之前，我们需要评估市场需求，调查感染此种病毒的人群分布情况，市场上是否已经存在针对此种病毒的疫苗产品，以及现有疫苗产品是否可以提供较强的预防能力。
  其次，调研病毒自身结构，感染生命周期，找到关键的可以阻断病毒感染能力的靶点蛋白。有的病毒，靶点选择非常明确清晰，例如新冠Spike蛋白，诱导机体产生的中和抗体，可以与Spike蛋白结合，从而抑制其与宿主细胞受体结合。有一些病毒，很难选取有效靶点来诱导中和抗体的产生。例如HIV病毒，其病毒基因组存在高度的遗传多样性，包膜糖蛋白的保守表位相对不易接近，病毒强大的免疫逃脱能力等。
  最后，还得要有可以用来进行疫苗效率评价的动物模型，如果没有动物模型，那也就无法进行体内试验。
  因此，一款疫苗的研发管线，需要综合考虑多种因素，才会去花费人力物力去启动管线。那么，就让我们带着这些问题，一起来看看如何进行单纯疱疹病毒（HSV-2）疫苗的研发吧。
  HSV-2病毒的威胁和疫苗研发现状
  Herpes simplex viruses，中文名称为人类单纯疱疹病毒，属于疱疹病毒科，分为疱疹病毒一型（HSV1）和疱疹病毒二型（HSV2）。HSV是一种广泛分布的嗜神经组织（neurotropic）病原体，潜伏期时，单纯疱疹病毒不传染，通过接触病毒复发期皮肤感染区而传染。HSV1主要感染口腔、面部、生殖器；HSV2主要感染生殖器。HSV-2主要通过性传播感染，在15岁-49岁的人群中，美国感染率是14 %，在全球范围内感染率是11 %。一旦被感染，即终身感染，周期性复发临床症状，有极高的风险传染给亲密伴侣或者新生儿。由于引发脑炎，肺炎，肝炎，每年全世界有14000新生儿感染HSV-2，导致非常严重的发病率和死亡率。生殖道疱疹病毒还会增加HIV感染和传播的风险。 疫苗研发现状
  作为一种理想的HSV疫苗,应该可以诱发消除性免疫,亦即在HSV侵入人类机体的各种途径如生殖道、口鼻黏膜等时都能够诱发有效的免疫应答,并对病毒的再感染具有抵抗力。自20世纪20年代开始，HSV-1和HSV-2疫苗已经开始在实验室进行研究，但其有效性并没有得到证实。最近的30年里，随着免疫学与细胞生物学技术的飞速发展，有了更多新的手段来研制新型HSV疫苗。比如近年来就有研究人员把目光放在关注感染与非感染者间T细胞识别位点是否具有差异性，因为这与病毒的反复暴发密切相关。
  目前研究较多且经过临床评估的疫苗主要有亚单位疫苗（subunit vaccine）、减毒活疫苗（attenuated live virus vaccine）、复制缺陷病毒疫苗（replication defective virus vaccine）、 DNA疫苗（DNAvaccine）以及载体疫苗（vector vaccine），但基本都处于早研阶段或者临床试验阶段，这些疫苗在不断建立起来的动物模型上取得重要的成效，但各有优缺点。故当前市面上没有任何一款已经获批的HSV疫苗，关于单纯疱疹病毒的mRNA疫苗研究之路略显漫长，仍需研究人员不断努力延拓。
  图2 SCI收录单纯疱疹病毒论文数量年际变化趋势
  上图是SCI收录世界各国HSV论文年代分布图。从中可以看出，HSV研究基本上呈平稳发展态势，在1992年论文数量是975篇，2007年度论文总数为1283篇，在15年的时间内，论文数量增长幅度为13.2% ,SCI收录HSV论文的峰值年代为2003年，论文数量为1354篇，2000、2002~2007年期间，论文数量都在1300篇上下，没有得到更大的发展。论文数量趋势在某种程度上反应了学科在社会科研体系中的影响力和受重视程度。
  HSV病毒结构
  HSV属于α疱疹病毒家族，从病毒结构上来看，属于非常经典的双链DNA病毒，病毒颗粒直径120-200 nm，病毒结构从内部核心向外侧依次是基因组核心（Core），核衣壳（Capsid），被膜（Tegument），包膜（Envelope）。
  图3 HSV病毒结构
  HSV病毒基因组HSV病毒基因组是152 kb线性双链DNA，由2个独特区域构成，UL和US构成，这两个区域侧翼均由反向重复序列组成（TRL/IRL和TRS/IRS），此结构是α疱疹病毒家族基因组典型特征。HSV病毒基因组可以表达75个蛋白，首先表达早期病毒基因，合成和晚期基因转录激活因子。病毒中期基因合成负责DNA复制的蛋白，晚期基因合成结构蛋白。
  图4 HSV病毒基因组
  此外，当病毒驻留神经元，处于潜伏状态时，基因组会变成环状，转录非常少的RNA，包括2个LATRNA，8个miRNA。miRNA在抑制早期病毒蛋白ICP0，ICP4，ICP34.5表达方面起着非常重要的作用。
  图5 潜伏期HSV病毒基因转录
  核衣壳（Capsid）包裹dsDNA的二十面体衣壳(icosapentahedral capsid)，由162个壳粒构成（capsomeres）。壳粒是构成衣壳的亚单位，由6个不同的病毒蛋白构成。
  被膜（Tegument）
  核衣壳和包膜之间存在一个蛋白质层，有20-23个不同的病毒被膜蛋白构成，起结构和调控作用。
  包膜（Envelope）
  包膜由位于病毒表面12个大小和形状不同的糖蛋白（glycoprotein）构成：gB，gC，gD，gE，gG，gH，gI，gJ，gK，gL，gM，gN。大多数包膜蛋白以单体形式存在，有些以异源二聚体的形式存在，例如gH/gL和gE/gI。
  HSV病毒如何入侵细胞
  一般认为HSV病毒通过附着（attachment）和融合（fusion）两个步骤完成入侵细胞，这一过程涉及多种宿主细胞表面受体和病毒包膜蛋白相互作用。在HSV-1病毒表面有11个包膜蛋白，至少有5个（gC，gB，gD，gH，gL）被认为参与病毒入侵宿主细胞的过程。附着HSV通过与宿主细胞表面蛋白聚糖（HSPG）的糖胺聚糖链（GAG）binding来实现跟宿主细胞的初步接触。宿主细胞表面的硫酸肝素（Heparan sulphate）被认为是HSV binding Receptor。gB或者gC与宿主细胞表面的硫酸肝素蛋白聚糖（HSPG）结合，使病毒颗粒和宿主细胞紧密接触，有助于在宿主细胞表面浓缩病毒颗粒。尽管这种结合可以极大提升HSV感染效率，但是，对于病毒进入细胞并非是必需的，如果宿主表面缺乏GAGs，HSV病毒对于细胞的感染会极大的减弱，但是不会终止，除非HSV entry Receptors缺乏，这表明gB或者gC/HSPG之间的相互作用非常重要，但是对于病毒入侵细胞来说不是必需的。
  融合
  在病毒附着到宿主细胞表面以后后，病毒进入细胞需要gD和宿主细胞 entry Receptors相互结合，从而触发病毒包膜和细胞膜融合，导致病毒核衣壳和被膜进入细胞质。除了HSPG，gB受体还包括PILRα和NMHC-IIA，通过与gH/gL作用形成膜融合机器。gD通过与宿主细胞表面受体结合，触发一系列激活膜融合的级联事件，是膜融合发生的关键，是gB与gH/gL相互作用前必要的步骤。
  gD
  HSV-1-gD是一个由369个氨基酸残基组成的糖蛋白，HSV-1-gD1和HSV-1-gD2在序列上有85%的同源性。从结构上来看，由膜外结构域（ectodomain），跨膜结构域（TMD）和短的细胞内尾巴构成。其ectdomain由两个结构完全不同的末端延伸结构域包裹一个IgV样的核心域结构组成，N-末端延伸区域拥有受体结合位点（RBD），可以跟宿主细胞特异性受体结合。C-末端延伸区域拥有触发膜融合的结构域（pro-fusion domian，PFD），与gH/gL或者gB发生相互作用。在与宿主细胞特异性受体结合之前，PFD与N末端结构域结合，形成自我抑制构象。当gD-RBD和特异性受体的结合时，引起gD发生构象变化，释放出N末端的PFD，使其能够和与gH/gL或者gB发生相互作用。PFD与gH/gL或者gB发生相互作用对于形成膜融合机器来说是必需的。gD与宿主细胞表面特异性受体的结合，对于HSV入侵细胞是必需的，缺乏gD的病毒可以结合到细胞表面（附着），但是无法进入细胞内。尽管gD既可以介导病毒附着细胞表明的过程，又可以启动病毒进入细胞的过程，但是有研究报道gD对于病毒附着细胞表面的过程来说是非必需的，因为病毒还可以通过其他的方式比如gB或者gC来实现这一过程（Heechung Kwon etal.,2006）。gD是宿主细胞体液免疫和细胞免疫的靶标。许多针对gD的单克隆抗体都有非常好的病毒中和滴度。
  图6 gD膜外结构域，绿色是IgV样的核心域结构，蓝色是N端延伸区域，橘黄色是C端延伸区域
  目前已经发现的HSV gD宿主细胞受体（entry receptors）有3种：第一个细胞受体是，HveA，疱疹病毒入侵介导因子，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，表达于激活的淋巴细胞表面，介导HSV病毒入侵细胞。第二个细胞受体是HveC，又叫做nectin-1，属于免疫球蛋白超家族成员，充当神经元细胞或者上皮细胞表面的黏附分子。第三个细胞受体是3-O-sulphate-modified heparan sulphate，其生物学功能还需要进一步研究。HSV-1和HSV-2在宿主细胞entry Receptors选择上有些不同。HVEM和nectin-1对于两种类型的病毒来说，都是非常好的进入受体，但是nectin-2对于HSV-1的入侵是没有结合活性的，对于HSV-2的入侵有很弱的结合活性。3-O-sulphate-modified heparan sulphate情况正好和nectin-2相反。
  图7 参与HSV入侵细胞的病毒包膜蛋白和宿主细胞表面特异性受体
  单纯疱疹病毒如何逃脱免疫系统
  HSV-1 gE可以结合IgG Fc结构域，干扰C1结合到抗原-抗体复合物上，抑制抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）。HSV-1 gC可以结合补体系统中的C3b，干扰C5和P蛋白与C3b结合的过程，加速旁路途径中C3转化酶的降解。因此这些表达病毒颗粒表面或者感染宿主细胞表面的免疫逃脱分子就成为特异性抗体的潜在靶标。阻断免疫逃脱能够提升天然免疫和由疫苗触发的免疫反应的效率。
  图8 HSV病毒糖蛋白gE和gC能够与抗体和补体发生相互作用来实现免疫逃脱
  Drew Weissman设计HVS-2 mRNA疫苗
  在2017年1月19号，Harvey M. Friedman在PlosPathogens发表文章《An HSV-2 Trivalent Vaccine Is Immunogenic in Rhesus Macaques and Highly Efficacious in Guinea Pigs》，动物试验数据显示，接种含有HSV-2 gC2，gD2，gE2三价蛋白疫苗（CpG和明矾作为佐剂）的恒河猴体内，可以触发机体免疫反应，避免阴道中度HSV病毒感染。三价蛋白疫苗可以为小鼠提供接近100 %的保护效率，防止病毒感染。因此，这种新型三价疫苗被认为是阻止人类生殖道疱疹病毒感染非常有前景的临床试验候选疫苗。
  图9 接种三价蛋白疫苗的小鼠预防病毒感染的能力
  2019年9月20号，Drew Weissman在ScienceImmunology上发表文章《Nucleoside-modified mRNA encoding HSV-2 glycoproteins C, D, and E prevents clinical and subclinical genital herpes》，利用mRNA技术来在体内表达三种病毒蛋白，试验数据表明，在小鼠和豚鼠体内，接种编码HSV-2 gC2，gD2，gE2三价mRNA-LNP疫苗的保护效果要比接种三价蛋白疫苗（CpG和明矾作为佐剂）更好，三价mRNA疫苗成为一个非常有前景的临床试验候选疫苗。接种方式mRNA疫苗通过皮下注射（ID）或者肌肉注射（IM），接种两针，间隔时间28天，每针疫苗包括3种组分mRNA（gC2，gD2，gE2），每种mRNA组分的量都是10 ug。
  图10 不同接种方式，不同类型HSV疫苗接种效果比较
  动物模型疫苗效率数据
  总的来说，不管是蛋白疫苗还是mRNA疫苗，接种两种类型疫苗的小鼠和豚鼠都可以阻止HSV-2病毒感染引发的阴道损伤。但是，在预防病毒感染引发的亚临床症状上，两款疫苗存在不同的保护效果。在急性感染第2天和第4天的时候，发现73 %（23/30）的接种蛋白疫苗的小鼠阴道培养物没有呈现出亚临床症状，而在接种mRNA疫苗的小鼠组内，98 %（63/64）的小鼠阴道培养物没有呈现出亚临床症状。在小鼠感染HSV-2第4天或者第5天的时候，背部神经节（DRG）里的HSV-2 DNA拷贝数就会达到峰值。在第4天急性感染的时候，50 %（5/10）的接种蛋白疫苗的小鼠DRG可以检测HSV-2 DNA拷贝，5.2 %（1/19）的接种mRNA疫苗的小鼠DRG可以检测HSV-2 DNA拷贝。通过检测接种疫苗小鼠血清中的IgG抗体滴度，针对HSV-2病毒的中和抗体滴度，能够结合gD2涉及细胞入侵的关键表位的抗体滴度，能够结合涉及免疫逃脱的gC2和gD2的抗体滴度，接种疫苗的小鼠CD4 T 细胞反应，辅助Tfh细胞反应和GC B细胞反应，发现接种mRNA疫苗的小鼠免疫学数据均优于接种蛋白疫苗的小鼠。
  总结
  HSV-2疫苗在靶点的选择上，精心挑选了涉及病毒入侵宿主细胞非常关键的包膜糖蛋白gD2，两个与病毒免疫逃脱有关的蛋白，gC2和gE2，一方面产生阻断病毒入侵宿主细胞的抗体，另外一方面产生防止病毒逃脱免疫系统攻击的抗体，从而能够提供一个非常高效的疫苗保护效率。我们可以看到HSV-2-mRNA疫苗的研发基本上是建立在前期蛋白疫苗取得的非常好试验数据的基础上，只是用mRNA技术重新走了一遍。值得一提的是，动物模型的数据表明，在相同靶点的情况下，mRNA疫苗要比蛋白疫苗取得更好的免疫学数据。新瓶装旧水，不仅省事，而且预防效果也会提升，何乐而不为。相信，此类保持靶点不变，更换mRNA技术路线的研发思路，在疫苗研发和抗体药物研发方向在未来一段时间内一定会不断涌现。
  参考文献：
  1.https://viralzone.expasy.org/5756
  2.Zhang, N., Yan, J., Lu, G. et al. Binding of herpes simplex virus glycoprotein D to nectin-1 exploits host cell adhesion. Nat Commun 2, 577 (2011).
  3.Crystal Structure of Herpes Simplex Virus 2 gD Bound to Nectin-1 Reveals a Conserved Mode of Receptor Recognition.
  4.Herpes Simplex Virus Cell Entry Mechanisms: An Update.
  5.Developments in Vaccination for Herpes Simplex Virus.
  6.Herpes Simplex Virus Type 1 Evades the Effects of Antibody and Complement In Vivo.
  7.Developments in Vaccination for Herpes Simplex Virus .
  8.An HSV-2 Trivalent Vaccine Is Immunogenic in Rhesus Macaques and Highly Efficacious in Guinea Pigs.