text: 本文将介绍最近发表在Journal of Chemical Information and Modeling上的一篇Perspective文章，AI-Based Protein Structure Prediction in Drug Discovery: Impacts and Challenges。该文章探讨了 AlphaFold2 和相关蛋白结构预测方法如何辅助提高药物设计效率，以及还存在哪些问题与挑战，包括预测结构域之间的取向、蛋白的多个相关构象状态、翻译后修饰的影响以及蛋白质结合状态引起的构象变化。——背景——蛋白分子是生物系统发挥功能的重要核心马达，因此了解蛋白及其结构功能对于我们了解生物过程以及药物设计至关重要。有了蛋白结构，我们便可以利用计算方法进行口袋检测、分子对接、虚拟筛选等来辅助药物设计过程。蛋白分子的真实三维结构往往是通过X射线晶体学、冷冻电镜与NMR等实验手段获得，这些实验手段费时费力，到目前为止蛋白数据库（PDB）中保存了实验解得的蛋白结构大约18万个，相比UniRef90中10亿条蛋白（基因）序列来说是非常少的。对于大多数没有已知结构的蛋白，则需要研究者进行实验测定或计算机建模。1973年Anfinsen 和 Scheraga提出假设：蛋白的氨基酸序列具有预测蛋白三维结构所需的所有信息，即蛋白序列可以决定蛋白结构。因此，最早的蛋白质结构建模与预测是以“高序列相似性的蛋白质应该具有相似的结构”为指导思想。之后，为了改善低相似度序列的结构预测，研究人员加入了BLAST序列比对、评分矩阵以及机器学习的数学模型。此外还有不依赖已知结构信息的无模板ab initio方法（只能用于小蛋白，计算成本很大），片段组装的建模方法（比如Rosetta）等。近几年，蛋白序列的共进化信息得到越来越多的关注。由于空间中距离较近的残基往往会一同突变进化，因此通过多序列比对（MSA），可以挖掘共进化信息，找到序列特征结构，例如AlphaFold 1。AlphaFold 2在1的基础上，实现直接端到端预测所有重原子坐标（不再是预测蛋白骨架的距离矩阵）；其次AF 2应用了不变点的注意力机制（Invarient point attention），从而保证欧氏变换的不变性。本文将简述以AlphaFold 2为代表的AI蛋白结构预测工作，为基于结构的药物发现带来的帮助，以及未来面临的挑战。——AI蛋白结构预测助力药物发现——图1 (A) 每个Pfam家族在PDB中已知蛋白质结构的数量。全环对应于100%（19179 个Pfam-domain-family）。内环的数字对应某个domain具有X个已知实验结构。可见超过75%的Pfam家族，仅有不到十个的已知实验结构。(B) AF2 蛋白质结构数据库中所有蛋白结构的平均pLDDT分数分布，按PDB覆盖率分组（>80%、20-80%、<20%）。垂直黑线表示CASP14中所有目标的平均pLDDT分数(83分)。由图1A可以看到大部分蛋白家族的实验结构信息是稀缺的，如果要针对一些未知结构的新蛋白靶点进行药物设计就需要借助结构预测工具来建模。图1B表明对于已知PDB结构的蛋白，AlphaFold 2预测结果的置信度（plDDT）分数比较高，而对于很多已知PDB结构覆盖较少的蛋白，AF 2也能给出置信度较高的预测结构，这为新蛋白靶点的药物设计提供研究切入点。此外，AF 2也预测残基之间的对齐误差（predicted aligned error, PAE），即残基之间预期的距离误差。PAE越小，说明残基之间相对距离比较固定，可能是在同一个结构域中，而一些PAE都比较大的残基，可能处在loop区。在图2B中可看到ERBB2 蛋白不同结构域可以从PAE图中分辨出，同时对于晶体结构中未发现的结构域的残基，在PAE中误差较大（颜色较浅）。图2 (A)人类受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2蛋白的结构，由预测的 pLDDT 评分着色。蓝色区域表示高置信度，而白色区域表示低置信度。(B) ERBB2 蛋白的预测对齐误差。——AI蛋白结构预测的未来挑战——1） 预测同一个蛋白的所有相关构象状态单一的蛋白结构可能不足以完全描述蛋白的生物学功能，一个蛋白的构象状态应该是一个集合，包含不同生理状态下的构象（活性或非活性、开放或关闭等）。AF 2虽然可以预测出5个蛋白结构模型，但是这些结构非常相似，并不能充分表示蛋白在不同生理状态下的构象。如下图3所示，AF 2预测的结构往往介于不同构象状态之间，并且在原理上也没有明确的生物学意义。图3  (A)人类钾离子电压门控通道H亚族成员2的冷冻电镜结构（5VA1，绿色）和AF 2预测（高置信区域，红色；低置信区域，灰色）。大部分AF 2的预测结构类似于冷冻电镜结构。(B)人类酪氨酸蛋白激酶 ABL1 的活性（1M52，绿色）和非活性形式（2HYY，蓝色）的激活环构象。AF 2预测（红色）仅类似于激活循环的活动形式。(C)丝裂原活化蛋白激酶-1(MAPK1)的磷酸化（活性，绿色，5V61）、非磷酸化（非活性，蓝色，2Y9Q）和AF 2（红色）的激活环构象。AF 2预测的结构介于活性和非活性构象之间。因此，如果未来AF能够改进模型，预测出更多差异化的构象，或是整合不同区域的动力学模拟，或是通过引入突变和降低MSA序列深度，都将对基于蛋白靶点结构的药物设计更加有益。2） 预测蛋白翻译后修饰的结构蛋白结构的变化和从活性状态到非活性状态的转变，往往与蛋白的翻译后修饰（PTM）有关，例如泛素化、磷酸化、乙酰化和甲基化。而这些PTM修饰后的残基或者PTM本身的分子基团目前还没有加入到AI结构预测工具的输入中，导致我们无法预测因PTM引起的结构变化。以干扰素调控因子 (IRF) 家族为例，如图4所示，IRF在磷酸化后倾向于二聚，而AF 2预测的磷酸化结构与PDB中无活性、未磷酸化的蛋白单体结构更像，即AF 2无法准确预测出磷酸化对结构带来的变化。图4 (A)IRF3的单体 (绿色，1QWT) 和二聚体 (粉色，5JEM) 的晶体结构以及AF 2对野生型序列 (蓝色) 和IRF3的拟磷突变体S386/396E (红色) 的预测结构。(B)二聚体(绿色，3DSH)的晶体结构和IRF5的野生型 (蓝色) 、拟磷突变体S435/446E (红色) 的AF 2预测结构。3） 预测多域结构由于AF 2和大多数AI模型都是在PDB数据集上进行训练，而PDB数据集本身都是偏向于容易结晶的蛋白以及单域结构，一小部分蛋白家族结构信息比较充分，然而还有很多蛋白家族的结构信息是有限的，如图5所述，因此这会导致这类AI模型会有数据偏差（bias），AF 2可以对单个结构域的预测很准，但是对于结构域之间的取向和相互作用的预测表现较弱。图5 (A) 在PDB中发现的每个UniProt家族 (n = 3892) 和UniProt超家族 (n = 331) 的蛋白质结构数量。70%以上的UniProt家族和50%以上的超家族的实验结构都少于5个。(B) Miransertib (灰) 与AKT1 (绿) 的PH和激酶域之间的口袋结合晶体结构。AF 2 (蓝) 预测的PH域(深蓝)的取向与晶体结构(深绿)不同。4） 预测蛋白与大分子的复合物结构目前AF 2只能预测单体蛋白结构，而蛋白复合物以及与其他生物大分子形成的复合物是发挥生物学功能更重要的载体，也是药物设计的重要目标。一些药靶结合的口袋是在复合物界面上，仅用单体结构是无法找到的，如图6所示。而随着AlphaFold Multimer等工作的出现，这点将有所改观。图6  (A) Tafamadis(灰色sticks)与运甲状腺素蛋白(5KCV)的四聚体结合示意图。(B) 配体小分子（灰色sticks）与CD40L同源三聚体(3LKJ)结合示意图。根据单体AF2结构 (青色cartoon和表面)，无法预测此类复合物界面的口袋。5） 预测蛋白与小分子配体多复合物结构蛋白与配体小分子结合的holo态结构是分析评估药靶结合能力的重要参考。如果仅通过未结合配体分子的apo态结构来找口袋，再进行分子对接虚筛，往往是简化忽略了配体分子对特定蛋白构象的偏好，以及配体分子对蛋白的诱导作用。如图7所示，AF 2学习的特征包括了两种状态的特征，因此预测的结构也处于一种holo态与apo态混合的形式，没有明确的意义与优势。独立预测apo态和holo态，找到药靶结合的pose，是目前许多分子对接工作正在努力解决的问题，十分具有挑战性。图7 谷氨酸电离受体AMPA型亚单位2的 apo态(灰) 和holo态(绿)结构，残基侧链变化较大。AF 2的预测结构(蓝) 介于holo态与apo态之间。6） 预测蛋白稳定性单点突变在蛋白质中频繁发生，它能够导致蛋白失去结构稳定性，可能导致遗传疾病与癌症的发生。AF 2等AI模型在预测本该因突变而展开的蛋白结构时（例如肿瘤抑制因子p53突变体），仍倾向得到折叠形态，因此可见在目前数据集上训练的AI算法，对于突变的影响不是很敏感。同时也反映了目前的AI结构预测工具，适用于二级结构含量较高的稳定蛋白，而对于具有长环、空腔等不稳定结构的蛋白，还不能很好解决其结构的表征。目前，已有一些工作专注于预测蛋白稳定性，因此可以尝试融合这些方法来改善AF 2等AI结构预测模型。——小结——笔者认为，AlphaFold 2在蛋白结构预测领域中具有里程碑式的意义，但是想要真正发挥应用价值，还需要解决不同场景下的具体问题，包括对蛋白动态、多构象结构系综的表征，更复杂多样的序列输入（非天然氨基酸、PTM等），以及与大分子、小分子形成复合物的结构预测。未来不止要在算法模型上改进，也需要更多样化的数据提供支持。Reference[1] Schauperl, M.; Denny, R. A. AI-Based Protein Structure Prediction in Drug Discovery: Impacts and Challenges.J. Chem. Inf. Model.2022. DOI: 10.1021/acs.jcim.2c00026.作者：黄志贤审稿：王世伟编辑：黄志贤GoDesignID：Molecular_Design_Lab（ 扫描下方二维码可以订阅哦！）