text: 基因工程的核心知识有哪些？
  【学习目标】1.简述PCR的原理、条件及过程。2.阐明基因工程的原理和基本操作程序。3.基于抗虫棉的培育过程的实例，采用文字和图示的方式说明基因工程的基本操作程序。4.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。【自主学习】1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。培育转基因抗虫棉一般需要步骤__________________，__________________，__________________，__________________。一、目的基因的筛选与获取1．目的基因2．筛选合适的目的基因3．利用PCR获取和扩增目的基因提示：引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始序列，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。存在于自然界中生物的DNA复制和人工合成中的多聚酶链式反应(PCR)之所以需要引物，是因为在DNA合成时DNA聚合酶只能从________端到3′端合成子链。(2)条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种________、四种________、________的DNA聚合酶。PCR过程参与的成分及其作用分别是？PCR的每一个循环都包括 ________ → ________ →________ 三个步骤，延伸后的产物又可以作为下一个循环的模板。二、基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的使目的基因能够表达和发挥作用。2．基因表达载体的组成[填图]（1）启动子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的_____（_____），紧挨转录的起始位点，是__________识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 有时为满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子。诱导物存在时，可_____或_____目的基因的表达。（2）终止子： 一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的_____（_____），标志着转录的_____。基因表达载体的启动子、终止子的作用，与起始密码、终止密码是否（同，相同）_____，启动子、终止子是_____上的，起始密码、终止密码是_____上的。（3）标记基因①作用：便于__________的筛选。②常见类型：__________基因、荧光蛋白基因等。（4）目的基因：如Bt基因。（5）复制原点作用：使能完成自主复制。3．基因表达载体的构建载体（质粒）    同种_______或能产生相同末端的______切割→带有相同含有目的基因的DNA片段__________（或_______）的切口→_____________作用下→重组DNA分子（重组质粒）。限制酶的选择方法根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。【思考】为什么必须构建基因表达载体,将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？（能，不能）原因__________提示：真核细胞的基因结构提醒　启动子≠起始密码子　终止子≠终止密码子①启动子是位于基因首端的一段特殊序列，它是RNA聚合酶识别、结合的部位。终止子是位于基因尾端的一段特殊序列，作用是使转录过程停止。②起始密码子和终止密码子均位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法目的基因应该插入到Ti质粒上的T-DNA片段中，以便T-DNA携带目的基因转移到受体细胞的染色体DNA上。提示：农杆菌转化法中有两次拼接和两次导入第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。Ⅰ.农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物；农杆菌的________上的__________能够整合到所侵染细胞的_______________上。目的基因导入受体细胞的方法合作探究：1.农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，（能，不能）利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？T-DNA的T是__________？为何要把目的基因接在T-DNA中？___________________2.将目的基因导入动物细胞的受体细胞除了受精卵方法：____________________，3.目的基因导入微生物细胞①方法：用 ____________________处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中_________________的生理状态，然后将___________导入其中。②常用受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。转化的意思：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。四、目的基因的检测与鉴定1．分子水平检测2．个体水平鉴定包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。接种实验例如_________________________饲喂棉铃虫。鉴定目的：确定目的基因是否赋予了转基因生物特定的              及程度。科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施是间行种植普通棉花原理是什么？有效吗？_______________________目的基因能否在真核细胞中稳定遗传的关键是什么？如何检测？一．选择题1.下列属于PCR技术所需条件的是（    ）①单链的核苷酸序列引物　②目的基因所在的DNA片段  ③脱氧核苷酸　④核糖核苷酸　⑤DNA连接酶　⑥DNA聚合酶　⑦限制酶    A.①②③⑤   B.①②③⑥       C.①②③⑤⑦     D.①②④⑤⑦2.质粒上的抗性基因在基因工程中的主要作用是(    )    A.使目的基因在受体细胞内易于表达    B.使受体细胞具有抗药性    C.有利于对目的基因是否导入受体细胞进行检测    D.促进目的基因与导入的外源基因相连接，提高转基因操作的成功率3.科学家已能运用基因工程技术，让羊合成并由乳腺分泌抗体，相关叙述中正确的是(    )①该技术将导致定向变异；②DNA连接酶能把目的基因与载体黏性末端的碱基对连接起来；③将目的基因导入受体细胞时采用显微注射技术；④受精卵是理想的受体。    A.①②④           B.①③④          C.②③④          D.①②③④4.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的方法正确的是（    ）①将毒素蛋白注射到棉受精卵中；②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中；③将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入农杆菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养；④将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，借助花粉管通道进入受精卵。A.①②             B.③④             C.②③           D.①④5.利用人胰岛B细胞构建cDNA文库，然后通过核酸分子杂交技术从中筛选目的基因，筛选过程如下图所示。下列说法不正确的是(    )A.cDNA文库的构建需要用到逆转录酶B.图中的菌落是通过稀释涂布平板法获得的C.核酸分子杂交的原理是碱基互补配对D.从该文库中可以筛选到胰高血糖素基因6.下列有关基因工程中目的基因的检测与鉴定的说法错误的是(    )A.通过PCR等技术检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因   B.通过PCR等技术检测目的基因是否转录C.检测目的基因是否表达用抗原——抗体杂交的方法D.目的基因的检测与鉴定是基因工程的核心步骤7.下列关于PCR技术的叙述，正确的是(　　)A．PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上B．该技术需要解旋酶和热稳定的DNA聚合酶C．该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的D．该技术应用体内DNA半保留复制原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件8.如图为基因表达载体的模式图，下列有关说法错误的是(　　)A．构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶B．任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别C．图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因9．下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是(　　)A．培育“黄金大米”可用花粉管通道法导入目的基因B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法C．目的基因导入大肠杆菌最常用的方法是Ca2＋处理法D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法A [水稻的花很小，不适合用花粉管通道法导入目的基因，A错误；将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，B正确；将目的基因导入微生物细胞最常用的方法是用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态，C正确；将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，此外还有基因枪法和花粉管通道法，D正确。]二．非选择题10．农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T­DNA插入植物基因组中。图示为利用农杆菌培育转基因植物的基本流程，请据图回答：[解析] (1)Ti质粒具多种限制酶切割位点，不同的限制酶识别并切割不同的碱基序列。连接平末端应选用T4 DNA连接酶。(2)目的基因主要是指编码蛋白质的基因。目的基因的首端具有启动子，以便于RNA聚合酶识别和结合。(3)过程③常采用Ca2＋(CaCl2溶液)处理农杆菌，以增大农杆菌细胞壁的通透性。抗生素抗性基因T用于检测受体细胞中是否含有基因表达载体。(4)检测农杆菌和愈伤组织细胞中是否有目的基因常采用PCR技术。[答案]　(1)不同的限制酶识别并切割不同的碱基序列T4 DNA连接酶(2)编码蛋白质的基因　启动子　RNA聚合酶