text: RNA干扰对小鼠腹腔活化巨噬细胞分泌TNF-α的影响
  肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)分为肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β，TNF-α生物学作用有杀伤肿瘤、促进炎症反应、抗炎、抗病毒、发热反应、免疫调节等，其主要由活化的巨噬细胞、T淋巴细胞和NK细胞分泌的，在多种其它细胞中也有低表达，如成纤维细胞、平滑肌细胞和肿瘤细胞。
  适量的TNF-α可以调节机体免疫功能，对维持机体内部的稳定状态及抵御各种致病因子具有重要意义，然而，TNF-α的异常分泌可作为机体炎症、损伤及休克的重要炎症介质。
  研究已证明TNF-α不仅对肿瘤细胞具有细胞毒性，还可以诱导产生多型白细胞介素和干扰素，这些细胞因子的网络活性可以相互协同，形成一系列连锁放大反应，加重炎症反应，最终导致机体的广泛损伤，造成诸如感染性休克、多器官损害、DIC等危重症的发生。
  TNF-α还具有对骨组织的吸收作用而造成对骨的破坏。
  目前己知与TNF-α有关的疾病包括:AIDS、贫血、肿瘤、出血性休克、移植排斥反应、结核病、白血病、糖尿病、类风湿性关节炎等。
  TNF-α参与了众多疾病的发生发展过程，因此在不同水平上阻断TNF-α，有可能对与TNF-α有关的疾病产生治疗作用。
  本试验利用silentGene-2 U6 Hairpin cloning Systems在体外经PCR合成siRNA表达框架，利用脂质体转染入细胞后，转录出shRNA引发干扰。
  针对小鼠TNF-α基因选取2个靶位点，测定并比较其干扰效果，从而选出敏感的抑制位点，为今后克隆质粒提供最强的干扰序列。
  本文就位点1干扰作用加以论述。
  1、小鼠腹腔巨噬细胞培养:C57BL/6小鼠，雄性(中国医科大学动物部提供)，腹腔注射2m110/1淀粉溶液，24小时后，颈椎脱臼法处死，无菌条件下，剪开腹腔，用4mlHank's液冲洗腹腔，收集冲洗液于离心管中，4℃离心，1000rpm，7min。
  弃上清，用无菌PBS洗细胞，4℃离心，1000rpm，7min，弃上清，用完全DMEM培养液调整细胞浓度，2×10~6个/ml，接种于6孔板。
  2、巨噬细胞TNF-α产生能力的监测:细胞正常生长后，每孔加10μg/mlLPS10μl，分别于刺激2小时、6小时、10小时、14小时检测其TNF-α的分泌量。
  干扰组:给予针对TNF-α干扰位点的siRNA表达框架。
  阴性对照组:给予正常DMEM培养液。
  阳性对照组:给予针对非同源siRNA表达框架，这里选择的是靶向IL-1某一位点的序列。
  4、干扰组及阳性对照组siRNA表达框架的获得及检测:从GeneBank中查找C57BL/6小鼠TNF-α、IL-1的序列。
  根据靶序列筛选原则及Promega公司shRNAtarget Disigner设计软件，经BLAST对比后，选择出编码靶标RNA的基因序列，由上海生工公司合成干扰组及阳性对照组下游引物，利用silentGene-2 U6 Hairpincloning Systems经PCR反应合成siRNA表达框架，纯化后，用2%琼脂糖凝胶电泳分析。
  5、RNA干扰作用特异性的测定:IL-1为淋巴细胞分泌的另一重要的细胞因子，将其作为阳性对照，可说明RNAi作用的特异性。
  6、TNF-αmRNA的检测:收集细胞，提取RNA，用RT-PCR方法检测TNF-αmRNA，操作步骤严格按照说明书进行。
  7、细胞因子的检测:干扰组、阳性对照组、阴性对照组取细胞培养液上清，用ELISA方法检测TNF-α、IL-1的分泌情况，操作严格按照说明书进行。
  1、LPS刺激腹腔巨噬细胞产生TNF-α量的动态变化:LPS刺激后，2小时TNF-α的分泌量开始上升，6小时表达达到高峰，10小时以后开始下降。
  2、干扰组及阳性对照组siRNA表达框架的获得及检测:
  干扰组下游引物序列:
  5'ATCTAAAAAGAGCACAGAAAGCATGATCAGAGAACTTGATCATGCTTTCTGTGCTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGA3'
  阳性对照组下游引物:
  5'ATCTAAAAAGCAAGCTATGGCTCATTCAGAGAACTTGAATGAGCCATAGCTTGCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGA3'
  引物合成后，利用silentGene-2 U6 Hairpin cloning Systems经PCR反应合成siRNA表达框架。
  3、RNA干扰作用对TNF-αmRNA水平的影响:干扰组TNF-αmRNA量较阳性对照组及阴性对照组均明显降低。
  5、RNA干扰作用对TNF-α浓度的影响:干扰组TNF-α分泌量较阳性对照组及阴性对照组均明显降低。
  1、RNA干扰可以有效地抑制原代培养小鼠腹腔巨噬细胞TNF-αmRNA水平及其蛋白的分泌量。
  2、RNA干扰有严格的序列特异性。
  3、针对位点1的干扰作用可以抑制小鼠腹腔巨噬细胞TNF-αmRNA的表达，该位点可以作为今后克隆质粒研究的敏感位点。
  总之，RNA干扰特异性抑制了哺乳动物腹腔巨噬细胞TNF-αmRNA的表达，为TNF-α相关疾病在基因水平上的治疗提供了可靠的依据。