text: 呼吸道合胞病毒感染过程中粘蛋白1的抗炎效应
  一直以来,RSV被认为是世界范围内导致婴幼儿严重呼吸道感染的主要病因。
  流行病学研究发现,RSV是造成5岁以下儿童由于呼吸道感染入院的主要致病因素。
  它可以引起下呼吸道炎症性疾病,如病毒性细支气管炎和肺炎,特别是在早产儿以及具有呼吸系统、心血管系统和免疫系统缺陷的病人,甚至是致命性的。
  RSV首次感染后不能有效地诱导机体免疫系统产生免疫记忆,因此,在人的一生中,RSV重复感染是经常发生的。
  不幸的是,经过50年的研究,还没有研制出有效的治疗方法,也没有成功开发出预防RSV感染的疫苗。
  RSV属于副粘病毒科中的肺炎病毒属,是一种负单链RNA病毒。
  其基因组由15,300个核苷酸组成,共编码11种蛋白质。
  呼吸道上皮细胞构成了从鼻腔到终末细支气管的第一道屏障。
  是病原体经呼吸道侵入机体后产生炎症反应的主要起始部位。
  RSV接近呼吸道上皮细胞并进入呼吸道上皮细胞内的过程激活机体的免疫系统。
  目前研究发现这些膜蛋白可能是Toll样受体(TLR)家族中的TLR2、TLR3、TLR4、TLR7或TLR8中的一种或多种。
  在哺乳细胞体内发现有12种TLRs。
  TLRs属于Ⅰ型糖基化膜蛋白。
  TLRs的N末端位于细胞外,含有16~28个富含亮氨酸的重复序列(LRR)。
  每个LRR由20~30个氨基酸残基编码,含有进化上保守的"LxxLxLxxN"基序。
  TLRs的C末端位于细胞内,其细胞内段含有Toll样受体/白细胞介素1受体结构域(TIR)。
  TIR结构域是TLRs细胞内段募集桥接蛋白进而活化下游信号通路所必需。
  通过对细胞膜上不同的TLRs和其配体所形成复合物的晶体结构解析发现,TLRs与其配体相互作用后,形成同源二聚体,如TLR3-TLR3,或异源二聚体,如TLR1-TLR2、TLR4-MD2等,即形成马蹄样结构(“m”型结构)。
  这一结构是TLRs与其配体相互结合并初始下游信号通路所必需。
  TLRs可以识别和结合多种来源于病毒、病原性细菌、病原性真菌和单细胞寄生虫等的病原相关分子模式(PAMP)物质。
  RSV与呼吸道上皮细胞表面的TLRs相互作用后,可以诱导其合成并释放多种细胞因子,如IL-6、IL-8、单核巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、转化生长因子(TGF)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。
  在这些细胞因子中,TNF-α的作用具有两面性。
  首先TNF-α在RSV感染早期有利于机体清除RSV,但是过多的TNF-α分泌或长时间的作用也可以带来严重的肺损伤。
  这正是有些感染RSV的小儿出现严重的下呼吸道症状,甚至死亡的原因。
  TNF-α是由纪念Sloan-Kettering肿瘤研究所的Loyd博士于1975年发现,其cDNA于1984年被克隆出来。
  TNF-α的前体物质是一种212个氨基酸残基编码的Ⅱ型跨膜蛋白质,以同源三聚体的形式存在于细胞膜上。
  这种TNF-α的前体物质在TNF-α转换酶(TACE)的蛋白切割作用下,生成可溶性的TNF-α。
  有活性的TNF-α必须以三聚体的形式存在,当TNF-α的浓度过低时,其三聚体趋于解聚,TNF-α进而失去活性。
  细胞膜上存在两种TNF受体(TNFR)。
  TNFR1在绝大多数组织表达,其可以被TNF-α的前体物质和TNF-α三聚体所激活。
  而TNFR2仅表达于免疫系统,可以被TNF-α的前体物质三聚体所激活。
  TNFR以三聚体的形式与TNF-α三聚体相互作用,进而传递信号。
  TNF-α与其受体相互作用后,TNFR的细胞内段发生构象变化,释放结合在死亡结构域上的抑制性分子SODD,暴露出来的死亡结构域可以和桥接蛋白TRADD相互作用,并可以招募下游信号分子,活化三条信号通路:1.活化核因子-κB(NF-κB);2.活化丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路;3.诱导调亡信号。
  因此TNF-α具有诱导细胞凋亡、诱导炎症、抑制肿瘤生长、抑制病毒复制的功能。
  这些功能的基础是TNF-α可以参与调控免疫细胞。
  同时,实验证实TNF的功能紊乱可以导致多种疾病,甚至是肿瘤。
  RSV是导致小儿呼吸道疾病及由此造成的死亡的主要原因。
  流行病学数据显示,尽管RSV感染在大多数小儿引起上呼吸道感染症状,但也有5%的患儿会演变成严重的下呼吸道感染,如细支气管炎。
  仅在美国,每年平均都会有130,000病人因为RSV感染造成的严重下呼吸道疾病入院。
  不仅如此,在老人和免疫功能不健全的人中,特别是接受骨髓移植的患者,RSV感染也会造成极高的病死率。
  而且,还有证据表明,早年RSV感染会使患者一生中患哮喘的几率增加。
  正如我们前边介绍的，TNF-α是造成以上情况的罪魁祸首。
  不幸的是,目前还没有研制出有效的预防RSV感染的疫苗,也没有行之有效的治疗药物。
  但我们注意到,在大多数患者体内,RSV感染还是一种自限性疾病。
  因此,在正常人体内必然存在一种负反馈调节机制来抑制RSV感染后过度释放的TNF-α,从而阻止由此产生的肺组织损伤。
  而MUC1具有抑制炎症的功能。
  更有意思的是,我们最近的数据表明,MUC1可以通过阻断TLRs信号通路来抑制病原体造成的TNF-α分泌。
  由此我们推断在正常机体内可能存在这样一种负反馈调控机制:RSV通过与呼吸道上皮细胞表面的TLRs相互识别与作用后,诱导其分泌TNF-α，上调的TNF-α通过TNFR1信号通路促进呼吸道上皮细胞表达MUC1,MUC1可以反过来通过阻断TLRs信号通路抑制过量的TNF-α生成,从而抑制肺损伤。
  MUC1是粘蛋白家族中的一个成员,是高度糖基化的膜偶联粘蛋白。
  其主要表达于上皮组织的管腔面。
  MUC1由细胞外段、跨膜段和细胞内段组成。
  细胞外段含有由20个氨基酸残基组成的串联重复序列(VNTR),其数目因人而异,从20~120个不等,还含有SEA结构域,是金属蛋白酶切割的部位。
  MUC1细胞内段含有多种基序,可以和磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)和生长因子结合蛋白2(Grb2)等多种蛋白质相互作用。
  这预示MUC1可以参与到多条细胞信号转导过程中。
  同时,MUC1在上皮细胞管腔面可以与多种病原体结合,起到保护呼吸道和消化道等不受病原体感染的作用。
  为了证实MUC1在RSV感染后确实具有抑制炎症的负反馈调节功能,我们设计了以下实验。
  实验分三个部分:
  第一部分即验证RSV感染是否可以诱导呼吸道上皮细胞分泌TNF-α和上调表达MUC1。
  细胞感染RSV 24 h后,分别收集细胞培养上清和细胞总RNA。
  运用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR),分别检测细胞上清中的TNF-α水平和MUC1 mRNA水平。
  结果发现:RSV感染可以诱导呼吸道上皮细胞分泌TNF-α和上调表达MUC1,并具有剂量依赖关系。
  第二部分即RSV诱导A549细胞表达MUC1和分泌TNF-α的时间关系研究。
  二者均使用ELISA方法检测。
  实验结果显示:RSV感染A549细胞后,MUC1表达水平从感染后12h开始增高,24h后达到高峰,并持续到48 h,72 h后开始下降。
  细胞培养上清中的TNF-α水平随时间变化曲线与MUC1不同。
  RSV感染A549细胞后,上清中的TNF-α水平在RSV感染6 h后即已升高(在感染后更早的时间即开始升高,未列出数据。)
  通过分析两者的时间关系我们发现,RSV感染诱导A549细胞分泌TNF-α早于MUC1表达上调,当RSV诱导的MUC1表达维持在峰值期间,TNF-α分泌反而减少。
  二者的时间变化曲线预示负反馈调控机制的存在。
  第三部分即运用可溶性1型TNF受体(sTNFR)、过表达及敲除MUC1来进一步验证MUC1在RSV感染后的负反馈抑炎机制。
  sTNFR的引入可以阻断RSV感染所造成的呼吸道上皮细胞MUC1表达上调,这说明RSV感染造成的呼吸道上皮细胞MUC1表达上调确实是TNF-α与TNFR1相互作用来诱导的;通过向呼吸道上皮细胞A549细胞中转染pcDNA3.1-MUC1来过表达MUC1,过表达的MUC1可以抑制RSV感染所造成的TNF-α分泌增多;相反,若在RSV感染后48 h,应用MUC1-siRNA下调MUC1表达,原本下降的TNF-α水平反而升高。
  综上所述,MUC1在RSV感染后期确实存在抑制炎症的作用。