text: T-2毒素诱导的细胞线粒体毒性作用研究
  : T-2毒素是由镰刀菌(Fusarium)产生的一种次级代谢产物,也是A类单端孢霉烯族毒素中毒性最强的一种。
  T-2毒素能够降低动物的食欲和增重,引起严重的经济损失。
  T-2毒素还可能通过食物链进入人们的餐桌,因此对动物和食品动物消费者的健康都具有较大的威胁。
  T-2毒素对食品动物的一个重要毒性作用是生长抑制效应。
  动物在长期低剂量摄入T-2毒素污染的饲料后会引起慢性毒性作用,包括食欲不振、生长发育迟缓、体重降低等,并导致动物饲料利用率明显降低,给养殖业带来巨大的经济损失。
  研究表明T-2毒素可能通过改变大脑中五羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)水平,降低动物的食欲;或者通过抑制动物肠上皮细胞的增殖,损害肠道微绒毛,导致肠道营养吸收受阻。
  本实验室前期对T-2毒素的生长抑制效应也做了研究,结果表明,T-2毒素对生长激素(Growth hormone,GH)的合成和分泌抑制可能是该毒素导致动物生长抑制的一个重要因素。
  另外,T-2毒素还能够损伤血脑屏障功能,增加其通透性,从而进入大脑并引起垂体的病理损伤。
  目前虽然观察到了T-2毒素引起的垂体损伤,但是其中的损伤机制还不清楚。
  氧化应激是指细胞中线粒体或其他来源的活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)产生过量而不能有效被清除,改变了细胞内氧化还原平衡(倾向于氧化),引起的一系列氧化损伤。
  结果表明,T-2毒素处理GH3细胞后显著增加细胞内ROS和线粒体超氧自由基含量,ROS不仅消耗了细胞内的还原物谷胱甘肽(GSH),还增加了DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量。
  T-2毒素在诱导氧化应激的同时,还激活了细胞抗氧化系统,包括增加抗氧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性,上调编码抗氧化酶的基因GPx-1、SOD-2、CAT、Ucp-1、Ucp-2和Ucp-3的表达水平,其中CAT和Ucp-3的表达水平上调了53倍和86倍,表明T-2毒素显著激活了这些抗氧化基因的表达,来抵抗氧化应激引起的损伤效应。
  电镜结果显示,T-2毒素明显诱导细胞形态变化,细胞内出现很多空泡,细胞和细胞核体积缩小。
  线粒体结构也发生了多种变化,如线粒体基质电子密度增加,有的线粒体嵴已经完全消失并形成空泡化线粒体,有的线粒体发生了肿胀,形成巨型线粒体。
  这些变化说明T-2毒素对线粒体具有明显的毒性作用,能破坏线粒体膜完整性。
  T-2毒素还引起GH3细胞凋亡,包括诱导凋亡小体形成,抑制抗凋亡基因Bcl-2表达,增加促凋亡基因Bax、p53和caspase-3、caspase-8表达,表明T-2毒素激活caspase依赖的线粒体凋亡通路来诱导GH3细胞凋亡。
  T-2毒素也增加了呼吸链中编码铁硫蛋白、黄素蛋白和血红素蛋白的基因表达,以及调控线粒体生物合成的转录/激活因子表达(如PGC-1家族成员、核呼吸因子和线粒体转录因子Tfam、Tfb1m和Tfb2m),这些变化可能源于T-2毒素诱导线粒体应激反应后的一种线粒体功能补偿效应。
  2.Ndufs3在T-2毒素诱导的线粒体功能变化中的作用研究本研究在GH3细胞中分别沉默和过表达Ndufs3,再利用40 nM T-2毒素孵育GH3细胞24 h,检测线粒体超氧自由基水平、复合物I活性、线粒体ΔΨm和ATP水平。
  结果表明,在GH3细胞中沉默Ndufs3能够显著抑制复合物I活性,降低线粒体ΔΨm,也能一定程度增加超氧自由基含量,降低ATP水平;而在加入T-2毒素后,沉默Ndufs3能进一步显著增加超氧自由基产生,降低复合物I活性和线粒体ΔΨm,说明Ndufs3表达缺陷能够引起线粒体功能障碍,也会增加GH3细胞对T-2毒素易感性,使线粒体更容易受到T-2毒素损伤。
  本研究在GH3细胞中过表达Ndufs3后,利用40 nM T-2毒素孵育细胞24 h,检测线粒体变化。
  结果表明,过表达Ndufs3后,线粒体复合物I活性、超氧自由基水平、线粒体ΔΨm和ATP水平都没有明显变化;而在加入T-2毒素后,过表达Ndufs3对这些参数也没有明显改变,表明在GH3细胞中过表达Ndufs3后加入T-2毒素处理,并不会对线粒体功能提供明显保护作用。
  通过染色质免疫共沉淀并结合PCR和高通量测序(ChIP-Seq),本研究确定了NRF-2在GH3细胞中是通过调控下列靶基因来控制线粒体功能。
  NRF-2能够结合到线粒体转录因子Tfam、Tfb1m和Tfb2m,复合物I铁硫蛋白亚基Ndufs3和Ndufs7,复合物I组装因子Ndufaf1、Ndufaf2和Ndufaf4,复合物IV组装因子COA5,以及其他基因如DNM1L、AR、DIAPH2、DDX55、FGF14、FAT3、NSFL1C、ZSCAN23、MYO3A和PEX5的启动子区。
  生物信息学分析表明,这些靶基因启动子区都含有NRF-2串联排列的GGAA或TTCC核心结合位点,NRF-2能够结合到这些位点增加靶基因的转录活性。
  本研究设计了扩增靶基因启动子的引物,对ChIP得到的DNA样品进行PCR和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)。
  对PCR产物跑胶并测序,结果表明,PCR产物跑胶后,NRF-2组都有条带,且条带大小与Input组相同,并且与预期大小一致。
  测序结果表明,这些扩增片段属于靶基因启动子片段,与预期的扩增片段相符,表明NRF-2确实能够结合到这些靶基因的启动子区。
  qRT-PCR结果也表明,相对于IgG阴性对照抗体对靶基因位点的富集,NRF-2目的抗体对靶基因启动子位点的富集都有显著性提高,进一步验证了ChIP-Seq结果的可靠性。
  4.T-2毒素诱导GH3细胞自噬和线粒体自噬研究为了深入研究T-2毒素是否能够激活GH3细胞自噬和线粒体自噬,为细胞提供保护作用,本研究首先利用双荧光标记的自噬标志物LC3(mRFP-eGFP-LC3)和mKeima荧光蛋白标记的线粒体(Mito7-mKeima)确定T-2毒素能否诱导GH3细胞自噬和线粒体自噬。
  通过腺相关病毒在GH3细胞中稳定表达mRFP-eGFP-LC3蛋白,利用10和40 nM T-2毒素孵育细胞24 h,通过共聚焦显微镜观察细胞自噬。
  通过慢病毒在GH3细胞中稳定表达Mito7-mKeima融合蛋白,利用10和40 nM T-2毒素处理细胞24 h,通过荧光显微镜观察线粒体自噬。
  结果表明,10和40 nM T-2毒素处理细胞后,mKeima蛋白的红色荧光强度明显增加,表明T-2毒素也能够诱导GH3细胞线粒体自噬。
  为了确定T-2毒素诱导的GH3细胞自噬和线粒体自噬是否依赖于Atg5自噬基因,本研究在GH3细胞中沉默Atg5,利用40 nM T-2毒素孵育GH3细胞24h,检测细胞自噬和线粒体自噬。
  类似地,40 nM T-2毒素处理正常GH3细胞24 h后,mKeima红色荧光明显增强;但是在Atg5沉默细胞中,T-2毒素增强的mKeima红色荧光明显减弱,这些结果表明沉默Atg5可以抑制T-2毒素诱导的GH3细胞自噬和线粒体自噬。
  本文也利用qRT-PCR和Western Blot检测了自噬蛋白LC3和Atg3和线粒体自噬关键基因Pink1、Parkin和NIX的表达水平。
  在蛋白水平上,10和40 nM T-2毒素处理GH3细胞24 h后,显著增加Pink1和Parkin蛋白表达。
  在基因水平上,10 nM T-2毒素处理GH3细胞后没有明显改变Pink1和Parkin表达,但是显著增加了NIX表达,而40 nM T-2毒素都显著增加了这三个基因的表达。
  在利用10和40 nM T-2毒素孵育GH3细胞24 h后,本研究检测cAMP-PKA-CREB信号通路激活,结果表明,10和40 nM T-2毒素处理GH3细胞后显著增加了cAMP水平和PKA激酶活性;而用PKA激酶抑制剂H89预处理细胞后能够显著抑制PKA活性增加。
  40 nM T-2毒素显著增加总CREB水平,10和40 nM T-2毒素都显著增加磷酸化CREB(p-CREB)水平,但是H89也抑制了CREB和p-CREB蛋白表达的增加。
  这些结果表明在GH3细胞中,T-2毒素能增加cAMP水平,cAMP进一步活化PKA,进而磷酸化CREB形成p-CREB,激活cAMP-PKA-CREB信号通路。
  在GH3细胞中沉默Nrf2后用40 nM T-2毒素处理细胞24 h,检测Pink1的表达,结果表明,沉默Nrf2后能显著降低T-2毒素诱导的Pink1表达增加。
  同时用H89预处理细胞后能够显著降低Nrf2和Pink1表达,说明PKA激酶能够调控Nrf2表达,而Nrf2又能够调控下游的Pink1,表明cAMP-PKA-CREB-Nrf2-Pink1这条信号通路在GH3细胞中能够调控线粒体自噬。
  本研究在GH3细胞中沉默线粒体自噬基因Pink1和NIX来抑制线粒体自噬活性,然后用T-2毒素处理细胞,检测线粒体融合与分裂基因Drp-1、Fis-1和Mfn-1表达、线粒体ATP水平和细胞凋亡。