text: Bruce a. Shapiro, Ph.d. | Centrum pro Výzkum Rakoviny | KGSAU
  kompletní pochopení funkce molekul RNA vyžaduje znalost jejich vyššího řádu konstrukcí (2D a 3D), jakož i charakteristiky jejich primární sekvence. Struktura RNA je důležitá pro mnoho funkcí, včetně regulace transkripce a translace, katalýzy, transportu proteinů přes membrány a regulace RNA virů. Pochopení těchto funkcí je důležité pro základní biologii i pro vývoj léků, které mohou zasáhnout v případech, kdy dochází k patologické funkčnosti těchto molekul.
  naše skupina provádí výzkum a vývoj metodik pro zlepšení technik skládání a analýzy RNA, které pomáhají dále porozumět funkčním vlastnostem těchto molekul. Kromě toho se zaměřujeme na vznikající oblast nanobiologie RNA. RNA představuje relativně nový molekulární materiál pro vývoj biologicky orientovaných nano zařízení. Je to zajímavý materiál, protože jeho přirozené funkce, jeho schopnost složit do složitých struktur a self-sestavit. Vyvinuli jsme výpočetní a experimentální metodiky, které umožňují návrh nanočástic na bázi RNA, které mají potenciálně různá použití. Tak, náš výzkum RNA pokrývá pět vysoce souvisí a integrované oblasti výzkumu:
  Výzkum v oblasti algoritmů pro RNA sekundární struktury, predikce a analýzy;
  RNA biologie a její vztah k pořadí a sekundární struktura skládací vlastnosti;
  výzkum algoritmů pro predikci a analýzu 3D struktury RNA a jejich aplikace v biologii RNA;
  výzkum algoritmů pro návrh a analýzu nanočástic RNA;
  experimentální návrh, syntéza a dodávka nanočástic na bázi RNA.
  to, Co se naučili v jedné oblasti, je aplikován na jiné oblasti, zlepšení našeho chápání RNA struktura, funkce a RNA nanobiologie a self-montáž.
  paralelní výpočetní biologie a struktura RNA
  revoluční změny ve výpočetních paradigmatech jsou nutné k udržení potřebné výpočetní síly k řešení problémů v molekulární biologii. Nelze očekávat, že metodiky založené na sekvenčních počítačových architekturách budou neustále držet krok s potřebnými výpočetními rychlostmi. Aby bylo možné přizpůsobit vysoké rychlosti, které jsou nezbytné, jsou nyní používány vysoce paralelní výpočetní techniky. Naše skupina byla jedním z průkopníků v oblasti výpočetní biologie a použití paralelní vysoce výkonných počítačových architektur pro toto úsilí.
  výpočetní techniky pro predikci a analýzu sekundární struktury RNA
  byli jsme první, kdo vyvinul techniku skládání RNA, která používá koncepty z genetických algoritmů. Náš algoritmus, MPGAfold, byl původně vyvinut pro provoz na masivně paralelním superpočítači SIMD, MasPar MP-2 s procesory 16384. Tento algoritmus byl upraven a nyní běží na paralelních vysoce výkonných linuxových klastrech. Výjimečné škálovací vlastnosti jsou získány se schopností spustit algoritmus se stovkami tisíc populačních prvků. Predikce pseudoknot RNA je součástí genetického algoritmu, což má za následek jeho schopnost předpovídat terciární interakce. Mezi další funkce patří simulace ko-transkripčního skládání, schopnost začlenit různá energetická pravidla a nucená inhibice a vkládání požadovaných spirálových stonků. Kromě toho, STRUCTURELAB, naše heterogenní bioinformatical RNA analýza pracovní stůl, může být použit ve spojení s MPGAfold a RNA2D3D vyrábět předpověděl 3D atomové souřadnice RNA struktur spolu s vizualizaci těchto struktur. Také jsme vyvinuli novou interaktivní vizualizační metodiku, která je součástí STRUCTURELAB. Tato technika umožňuje srovnání a analýzu mnohočetných sekvencí RNA záhyby z fylogenetických pohledu, což umožňuje zlepšení předpokládané strukturální výsledky celé rodiny sekvencí.
  vyvinuli jsme knetfold, nový a výkonný algoritmus pro predikci struktury RNA z zarovnání sekvencí. Algoritmus používá k predikci struktur unikátní hierarchickou klasifikační síť založenou na vzájemné informaci, termodynamice a Watson-Crickově báze. Kromě toho jsme vyvinuli webovou aplikaci CorreLogo, která používá vzájemné informace odvozené z zarovnání sekvencí RNA k určení kovariací mezi pozicemi spárovanými se základnou. Algoritmus obsahuje unikátní chybovou míru a zobrazuje výsledky ve 3D.
  vyvinuli jsme, CyloFold, jedinečný algoritmus pro predikci, z jedné sekvence, RNA sekundární struktury, které mohou zahrnovat pseudoknoty. Tento algoritmus využívá nové techniky, která se blíží potenciál pro 3D stérické střety v předpokládané struktury, tedy odfiltrování těchto struktur z úvahy. Ukázalo se, že algoritmus má vysokou přesnost ve srovnání s jinými algoritmy svého typu.
  vyvinuli Jsme software pro web založené na Bayesovské statistické přístup, který odhadů přesnost základní párové formace z údajů získaných z TVARU (Selektivní 2′ – Hydroxylu Acylace analyzovány Primer Extension) experimenty. Statistické / pravděpodobnostní výsledky byly odvozeny analýzou známých struktur RNA 3D s různými typy známých interakcí bází a jejich korelací s hodnotami tvaru. Bylo prokázáno, že nízké hodnoty tvaru dobře korelují s interakcemi párování a stohování základny Watson-Crick, zatímco vysoké hodnoty tvaru označují jednotlivé oblasti. Zlepšení bylo možné vidět, pokud byl také zohledněn základní kontext 2 nebo 3. Také jsme ukázali, že jiné typy známých interakcí nekorelovaly dobře. Tento typ informací je užitečný při konečném určení sekundární struktury RNA.
  výpočetní studie drah skládání RNA
  dráhy skládání RNA se ukázaly jako velmi důležité pro stanovení funkce RNA. Studie naznačují, že RNA může vstoupit do mezilehlých konformačních stavů, které jsou klíčem k její funkčnosti. Tyto stavy mohou mít významný dopad na genovou expresi. Je známo, že biologicky funkční stavy molekuly RNA nemusí odpovídat jejich minimální energetickou stát, že kinetické bariéry může existovat, že pasti molekuly v místní minimální, že skládací se často vyskytuje během transkripce, a existují případy, ve kterých molekula bude přechod mezi jedním nebo více funkční konformace před dosažením jeho rodném státě. Metody pro simulaci skládacích drah molekuly RNA, včetně ko-transkripčního skládání a lokalizace významných mezilehlých stavů, jsou tedy důležité pro predikci struktury RNA a její přidružené funkce. Několik biologických drah skládání RNA bylo úspěšně studováno pomocí MPGAfold a STRUCTURELAB. Příklady zahrnují hlízy bramborového vřetena viroid, mechanismus zabíjení hostitele plazmidu Escherichia coli R1, virus hepatitidy delta, HIV a virus dengue. Tyto výpočetní výsledky jsou v souladu s výsledky odvozenými z biologických experimentů. Kromě toho, byly předpovězeny nové strukturální interakce a důležité funkční přechodné a nativní stavy. To vedlo k dalším úspěšným potvrzovacím experimentům.
  Výpočetní Predikce RNA Interakce Sítí
  Jsme také vyvinuli programy CovaRna a CovStat prozkoumat long-range co-různé RNA interakce sítí s využitím celého genomu zarovnání. Tato nová metodika, která byla aplikována na genomy Drosophila, je v současné době aplikována na jiné genomy. Paralelní verze programu byla navržena pro urychlení zpracování a algoritmy se také spoléhají na rychlá indexovací schémata a konzervativní statistické metody k určení vysoce významných interakcí. Metodika našla zajímavé interakce, které souvisejí s endogenními siRNA, transportem genů a geny souvisejícími s morfogenezí.
  výpočetní studie trojrozměrných struktur RNA
  některé strukturní prvky molekul RNA byly studovány pomocí molekulární mechaniky a simulací molekulární dynamiky. Struktury se zabývat, zahrnují RNA tetraloop kde teplotně závislé denaturace tetraloop a následné znovusložení do původní krystalové struktury byly provedeny. Byla prozkoumána třícestná křižovatka z centrální oblasti jádra ribozomální podjednotky 30. let z Thermus thermophilus. Bylo experimentálně zjištěno, že mezimolekulárních interakcí mezi tři-způsob spojení a S15 ribozomální protein zahájit proces montáže 30S ribosomální podjednotky. Pomocí simulací molekulární dynamiky jsme získali vhled do konformačních přechodů křižovatky spojené s vazbou S15. Zjistili jsme pomocí molekulární dynamiky simulace, strukturální účinky, využití nových typů modifikovaných RNA nukleotidy obsahující carbocyclic cukry, které jsou omezeny na sever nebo na jih konformací (C2′ a C3′ – exo). Kromě toho jsme ukázali pomocí simulací molekulární dynamiky, jak ionty a doprovodné báze hrají velmi důležitou roli v konformacích monomerů s líbáním viru lidské imunodeficience (HIV). Tyto výsledky dobře korelují a mohou podrobně vysvětlit experimentální studie, které naznačují význam iontů pro dimerizaci HIV-1.
  zkoumali jsme také pseudoknot doménu telomerázy. Bylo provedeno molekulární modelování a molekulární dynamika domény pseudoknot, včetně její vlásenky. Výsledky ukázaly, jak dynamika smyčky vlásenky ovlivnila otevírání a zavírání nekanonických párů bází U-U nalezených ve stonku. Otevření navrhlo nukleační body pro tvorbu pseudoknotu. Také jsme zkoumali vliv dyskeratóza congenita (DKC) mutace v obraze, a jak se snižuje sklon pro otevření stonku tím, že tvoří relativně stabilní vodíkové vazby sítě v vlásenka smyčka. Modelovali jsme samotný pseudoknot pomocí našeho softwaru RNA2D3D v kombinaci s fylogenetickou analýzou. Studovali jsme dynamický dopad mutací DKC na pseudoknot s tím výsledkem, že pseudoknot se stal nestabilním, zatímco forma vlásenky se stala stabilnější.
  Jsme objevili, a objasnit 3D konstrukce nových typů translační zesilovače, které se nacházejí v 3′ UTRs Tuřín Vráska Virus (první svého druhu našel) a Pea enation Mosaic Virus. Objev těchto konstrukčních prvků přineslo na světlo nové mechanismy pro translační vylepšení v eukaryotické rostlinné viry, které mohou mít širší důsledky pro pochopení translační mechanismy obecně. Toho bylo dosaženo kombinovaným použitím MPGAfold, náš software pro 3D molekulární modelování RNA2D3D, a úzké interakce s našimi experimentálními spolupracovníky. Také jsme modelovali nový pseudoknot nalezený v mRNA CCR5. Tento pseudoknot se podílí na posouvání snímků a zdá se, že je stabilizován mikroRNA, nová funkce pro mikroRNA.
  kromě toho jsme použili metody založené na elastické interpolaci sítě ke snížení výpočetních nákladů souvisejících s RNA 3D dynamikou. Trajektorie trojrozměrné dynamiky lze určit pomocí snížené reprezentace atomu a daných konformačních stavů. Výpočetní čas lze pomocí tohoto přístupu zkrátit z týdnů na hodiny.
  Výpočetní RNA Nanobiologie
  RNA nanobiologie představuje nové řešení pro rozvoj nanopřístrojů, které mají potenciál pro použití v řadě oblastí, včetně léčiv. V návaznosti na naše zkušenosti, jak je uvedeno výše, jsme vyvinuli několik výpočetních a experimentálních technik (viz níže), které poskytují prostředky k určení souboru nukleotidových sekvencí, které lze sestavit do požadované nano komplexy. Jedním z těchto nástrojů je relační databáze s názvem RNAJunction. Databáze obsahuje informace o struktuře a sekvenci pro známé spirálové spoje RNA a interakce líbací smyčky. Tyto motivy lze hledat různými způsoby a poskytnout zdroj pro stavební bloky RNA nano. Další výpočetní nástroj, NanoTiler, umožňuje uživateli konstruovat určené tvary nanometrů na bázi RNA. NanoTiler poskytuje 3D grafické zobrazení objektů byl navržen a poskytuje prostředky pro interaktivní práci nebo s počítačem skripty na design proces, i když přesné RNA sekvence nemusí být ještě uvedeno, a all-atom model není k dispozici. NanoTiler můžete použít 3D motivy nalezené v RNAJunction databáze s těmi, specifikovaný RNA sekundární struktury vzorů vybudovat definovanými RNA nano tvar. Také kombinatorické vyhledávání lze použít k výčtu struktur, které by normálně nebyly brány v úvahu.
  Další web-based software nástroj pro RNA již design je NanoFolder, což je jedna z mála softwarových nástrojů, které jsou schopny předpovídat strukturu a posloupnost atributů multi-pletl RNA konstrukty. Pomocí tohoto programu je možné zadat sekundární struktura motivů a software předpovědět souboru sekvencí, které generují tyto požadované motivy se správnou intra – a inter-strand, skládací vlastnosti.
  Experimentální RNA Nanobiologie
  na Základě výše popsaných výpočetních přístupů k RNA nanodesign jsme prokázali schopnost experimentálně self-montáž a functionalize několik RNA na bázi nanočástic. Toho bylo dosaženo úzkými interakcemi mezi experimentálními a výpočetními přístupy, které vedly k vylepšení obou sad metodik. Příklady zahrnují self-montáž 6 a 10 pletl kostky; self-montáž hexagonální kroužky různých velikostí a dvojité kroužky s využitím RNA motiv extrahované z přírody; modifikace sekvencí v motivu pro zlepšení výnosu při zachování vhodných geometrií; a vlastní montáž trojúhelníkových struktur. Vyvinuli jsme také techniky, které definují protokoly vlastní montáže a které umožňují ko-transkripční sestavení konstrukcí, které mohou také zahrnovat modifikované báze pro zvýšení chemické stability těchto nanočástic. Kromě toho, máme funkcionalizovaných tyto částice s až šesti různými sirna umožnit kontrolované stechiometrie a umlčování genů, a ukázal, že tyto částice skutečně ticho určené geny, když transfektovaly do různých buněčných linií.
  zkoumali jsme také další paradigma založené na použití hybridních nanokonstruktur RNA / DNA obsahujících dělené funkcionality. To umožňuje, například, rozdělení Diceable siRNA do dvou DNA/RNA hybridní komponenty s DNA toeholds, které při transfektovaly do buněk sestavuje do DNA duplex a Diceable siRNA. Tento hybridní přístup byl začleněn do našich hexagonálních nanoringů a nanokub. Užitečnost tohoto přístupu umožňuje, mimo jiné, kontrolovaná aktivace funkce, začlenění molekulární majáky na DNA, aniž zasahující do RNA funkčnost a odolnost vůči nuclease degradace. Tento přístup byl úspěšně vyzkoušen v buněčných kulturách a xenografických nádorových myších modelech.
  mnoho výpočetních systémů bylo přizpůsobeno jiným prostředím uvnitř i vně naší laboratoře a NIH a jsou přístupné prostřednictvím našich webových stránek na http://www-CCRNP.ncifcrf.gov/~bshapiro.